基于微腔形光纤SERS探针的牛奶中抗生素检测研究.pdf

硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 MASTER’S DISSERTATION 论文题目 基于微腔形光纤 SERS 探针的牛奶中 抗生素检测研究 作者姓名作者姓名王振兴 学位类别学位类别工程硕士 指导教师指导教师付兴虎 教授 2021 年年 5 月月 中图分类号O433.4学校代码 10216 UDC535.8密级公开 工程硕士学位论文工程硕士学位论文 基于微腔形光纤 SERS 探针的牛奶中抗生素 检测研究 硕 士 研 究 生王振兴 导师付兴虎 教授 副导师邓丽华 高级工程师 申请学位工程硕士 学科专业光学工程 所在单位信息科学与工程学院 答辩日期2021 年 5 月 授予学位单位燕山大学 ADissertation in Optical Engineering RESEARCH ON DETECTION OFANTIBIOTICS IN MILK BASED ON MICROCAVITY FIBER SERS PROBE by Wang Zhenxing Supervisor Professor Fu Xinghu Yanshan University May, 2021 燕山大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明此处所提交的硕士学位论文基于微腔形光纤 SERS 探针的牛 奶中抗生素检测研究，是本人在导师指导下，在燕山大学攻读硕士学位期间独立 进行研究工作所取得的成果。论文中除已注明部分外不包含他人已发表或撰写过的 研究成果。对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 注明。本声明的法律结果将完全由本人承担。 作者签字日期年月日 燕山大学硕士学位论文使用授权书 基于微腔形光纤 SERS 探针的牛奶中抗生素检测研究系本人在燕山大学攻 读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文。本论文的研究成果归燕山大学 所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人完全了解燕山大学关于 保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送交论文的复印件和电子 版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权燕山大学，可以采用影印、缩印或其它复 制手段保存论文，可以公布论文的全部或部分内容。 保密□，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密□。 请在以上相应方框内打“√” 作者签名日期年月日 导师签名日期年月日 摘要 - I - 摘要 牛奶中的抗生素残留主要来源于奶牛的养殖过程中各种抗生素的不合理使用， 长期食用含有微量抗生素的牛奶会对人体造成危害。现有的抗生素检测手段虽然具 有较高的检测精度，但是存在样品预处理复杂和耗时长等缺点。因此，本文将表面 增强拉曼散射SERS技术和光纤传感技术相结合实现牛奶中抗生素的痕量检测。 本文介绍了课题研究的背景及意义， 对现有抗生素检测的现状和光纤SERS探针 的研究现状进行广泛的调研， 提出了基于微腔形光纤SERS探针的牛奶中抗生素检测 研究。主要研究内容如下 首先，介绍了 SERS 的增强机制和其增强因子的计算方法，阐述了光纤 SERS 探针的传感原理； 其次，研究了纳米银溶胶基底和微腔形光纤SERS探针基底的制备与表征；介绍 了实验系统及条件，探究了渐变折射率多模光纤的腐蚀时间与微腔长度的关系；采 用化学法制备了两种不同的SERS活性基底，并对其进行表征分析； 再次，探索了不同SERS活性基底的性能；对不同腐蚀时间的光纤探针进行性能 测试， 分析了光纤SERS探针的结构参数， 探究并对比了纳米银溶胶基底和光纤SERS 基底的灵敏度、再现性、稳定性等性能；对比分析了制备的光纤SERS探针与相关文 献的性能； 最后，采用微腔形光纤SERS探针基底，研究了牛奶中氟喹诺酮类抗生素和β-内 酰胺类抗生素含量检测；分析了恩诺沙星和阿莫西林的特征峰归属；研究了牛奶中 恩诺沙星和阿莫西林的检测灵敏度、再现性、回收率等；检测分析了牛奶中混合抗 生素的成分。 关键词多模光纤；抗生素检测；表面增强拉曼散射；银溶胶；光纤 SERS 探针 燕山大学工程硕士学位论文 - II - Abstract Antibiotic residues in milk mainly come from the unreasonable use of various antibiotics in the breeding process of dairy cows. Long-term consumption of milk containing trace antibiotics will cause certain harm to the human body. Although the existingantibioticdetectionshavehighdetectionaccuracy,theyhave disadvantages such as introducing complicated sample pretreatment, time-consuming and so on. Therefore, this paper studies the surface-enhanced Raman scattering SERS technology combined with fiber sensing technology to achieve trace detection of antibiotics in milk. In this paper, the background and significance of the subject research are introduced, and the current status of antibiotic detection and the research status of fiber SERS probe are extensively investigated. A reserach on the detection of antibiotics in milk based on a microcavity optical fiber SERS probe is proposed. The main contents are summarized as follows. Firstly, the enhancement mechanism of SERS and the calculation of its enhancement factor are described in detail. The sensing principle of fiber SERS probe is explained. Secondly, the preparation and characterization of nano-silver sol substrate and microcavity fiber SERS probe substrate were studied. The experimental system and conditions were introduced. The relationship between the etching time of graded index multimode fiber and the length of microcavity was explored. Two different SERS active substrates were prepared by chemical s. In addition, they were characterized and analyzed. Thirdly, the perances of different SERS active substrates are explored. The perances of fiber probes with different etching time were tested. The structural parameters of fiber SERS probes were analyzed. And various perances of nano-silver sol substrate and fiber SERS probe substrates were explored and compared, such as sensitivity, reproducibility, stability and so on. The perance of the prepared fiber Abstract - III - SERS probe and related literature were compared and analyzed. Finally, the microcavity fiber SERS probe substrate was used to detect the residues of fluoroquinolone antibiotics and β-lactam antibiotics in milk respectively. The characteristic peaks of enrofloxacin and amoxicillin were attributed and analyzed. The sensitivity, reproducibility and recovery of enrofloxacin and amoxicillin in milk were investigated. The composition of mixed antibiotics in milk is detected and analyzed. Keywords multimode fiber; antibiotic detection; surface-enhanced raman scattering; silver sol; fiber SERS probe 燕山大学工程硕士学位论文 - IV - 目录 - V - 目录 摘要...................................................................................................................................I Abstract................................................................................................................................II 第 1 章 绪论....................................................................................................................1 1.1 课题研究背景及意义.............................................................................................. 1 1.2 抗生素检测的现状分析.......................................................................................... 2 1.3 光纤 SERS 探针的国内外研究现状.......................................................................4 1.3.1 激光诱导化学沉积法........................................................................................4 1.3.2 溶胶自组装法....................................................................................................5 1.3.3 真空蒸镀法和物理磁控溅射法........................................................................6 1.4 论文内容及章节安排.............................................................................................. 7 第 2 章 光纤 SERS 探针的基本原理.................................................................................8 2.1 引言.......................................................................................................................... 8 2.2 表面增强拉曼光谱.................................................................................................. 8 2.2.1 SERS 增强机理...................................................................................................8 2.2.2 SERS 增强因子的计算方法.............................................................................11 2.3 光纤 SERS 传感原理.............................................................................................13 2.4 本章小结................................................................................................................ 14 第 3 章 不同 SERS 基底的制备与表征...........................................................................15 3.1 引言........................................................................................................................ 15 3.2 实验系统及条件.................................................................................................... 15 3.2.1 实验系统..........................................................................................................15 3.2.2 实验仪器与材料..............................................................................................15 3.3 纳米银溶胶基底的制备........................................................................................ 16 3.4 微腔形光纤 SERS 探针基底的制备.....................................................................17 3.4.1 光纤微腔结构的制备......................................................................................17 3.4.2 银纳米粒子修饰光纤探针..............................................................................19 3.5 SERS 基底的表征...................................................................................................20 3.5.1 紫外-可见分光光度计分析.............................................................................20 3.5.2 透射电子显微镜表征分析..............................................................................21 3.5.3 场发射扫描电子显微镜表征分析..................................................................21 3.5.4 拉曼光谱表征分析..........................................................................................23 3.6 本章小结................................................................................................................ 24 燕山大学工程硕士学位论文 - VI - 第 4 章 不同 SERS 基底性能比较...................................................................................25 4.1 引言........................................................................................................................ 25 4.2 微腔形光纤 SERS 探针结构参数的选择.............................................................25 4.3 两种不同 SERS 基底的性能.................................................................................27 4.3.1 纳米银溶胶基底性能......................................................................................27 4.3.2 微腔形光纤 SERS 探针基底性能...................................................................34 4.4 结果与讨论............................................................................................................ 41 4.5 本章小结................................................................................................................ 42 第 5 章 基于光纤 SERS 探针的牛奶中抗生素检测.......................................................43 5.1 引言........................................................................................................................ 43 5.2 牛奶中氟喹诺酮类抗生素的检测........................................................................ 43 5.2.1 样品的制备......................................................................................................43 5.2.2 样品特征峰分析..............................................................................................44 5.2.3 实验结果与分析..............................................................................................45 5.3 牛奶中β-内酰胺类抗生素的检测........................................................................48 5.3.1 样品的制备......................................................................................................49 5.3.2 样品特征峰分析..............................................................................................49 5.3.3 实验结果与分析..............................................................................................50 5.4 牛奶中混合抗生素的检测研究............................................................................ 54 5.4.1 样品特征峰分析..............................................................................................54 5.4.2 实验结果与分析..............................................................................................55 5.5 对比分析................................................................................................................ 57 5.6 本章小结................................................................................................................ 58 结论................................................................................................................................59 参考文献............................................................................................................................60 攻读硕士学位期间承担的科研任务与主要成果............................................................67 致谢................................................................................................................................68 第 1 章 绪论 - 1 - 第 1 章 绪论 1.1 课题研究背景及意义 当前社会，食品安全不仅是中国面临的公共卫生问题，也是世界性和全球性的 重大难题。自 2000 年起， “奶粉中三聚氰胺”、 “瘦肉精”、 “红心鸭蛋”以及“水 产品中氯霉素残留”等食品安全问题不断出现。随着我国经济的不断发展，日常食 品的安全问题也被人们广泛关注。畜牧养殖业中的抗生素残留问题是影响人们日常 食品安全因素的众多元素之一[1,2]。 研究表明，世界上生产的近 80的抗生素用于动物[3]。抗生素在畜牧养殖业中 的主要作用是降低动物的饮食量、促进动植物的生长速度和一定程度上提高动物的 免疫能力，从而有效地降低养殖成本[4]。牛奶中的抗生素残留主要是由于抗生素等 兽药的不合理使用，从而通过奶牛本身流入牛奶中。抗生素的滥用会使耐药菌株迅 速出现，进而导致疾病流行[5]。虽然残留在牛奶中的抗生素量为微量，但长时间食 用也会使抗生素在人体内聚少成多，进而导致人体免疫力下降[6]、抗药性增加[7]、慢 性中毒[8]和基因突变[9]等。 目前，高效液相色谱法High Perance Liquid Chromatography, HPLC、分子 印迹聚合物法、免疫色谱分析法以及液质联用法是常用的抗生素检测技术，具有很 高的准确性和可靠性，但它们都需要复杂的预处理环节、昂贵的实验设备、较长的 检测时间以及专业操作等[10]。因此，亟需一种无需处理样品、操作简单、快速以及 灵敏的检测方法。 拉曼光谱检测是一种无需处理样品、操作简单和快速的检测手段，但普通的拉 曼检测信号较弱，难以检测痕量物质。20 世纪 70 年代，表面增强拉曼散射 Surface-enhanced Raman Scattering， SERS技术的出现有效地解决了拉曼信号微弱的 缺点。由于 SERS 技术能够显著地放大拉曼信号且具有无需处理样品、快速、痕量 检测的能力， 因此该技术在基础和实际应用方面引起了世界范围内的广泛关注[11,12]。 光纤由于其体积小、可远程传输信号并且可制备出多种用途的传感器而广泛应 用于通信、国防和医学等多种领域。近年来，研究人员将光纤传感与 SERS 技术相 结合，制备出了性能良好的光纤 SERS 探针，可以同时实现拉曼信号的大幅度增强 和良好的检测再现性[13]。 以生物材料、 金属材料以及硅材料为衬底制备的传统 SERS 燕山大学工程硕士学位论文 - 2 - 基底虽然表现出优良的灵敏度，但是不能满足远程、现场以及危险环境的检测，具 有一定的局限性。 基于光纤的传播特性使光纤 SERS 探针基底可有效增加光和待测分子的作用面 积，使受激分子的数量显著增加，从而产生高强度的 SERS 信号[14]。由于光纤探头 收集的 SERS 信号是整个 SERS 活性区域的集合，大大降低了 SERS 基底对“热点” 均匀分布的要求，并提高了信号可重复性[15]。此外，当检测有毒和挥发性的物质时， 还可以防止拉曼系统的光学透镜受到污染。由于光纤 SERS 探针具有分子结构识别 能力、SERS 高灵敏度和远程检测等优点[16]，因此可用于食品安全检测[17]、农残化 学分析[18]和生物医学检测[19,20]等多种领域，可实现低浓度样品分子的检测和 SERS 信号原位、在线及远程探测分析[21]。 1.2 抗生素检测的现状分析 目前，HPLC、分子印迹聚合物法、免疫色谱分析法以及液质联用法是常用的抗 生素检测技术。 1高效液相色谱法 Kargin[22]等基于 HPLC 采用 Mg2离子对牛奶中的四环素TC、氧四环素以及强 力霉素进行荧光标记实验，得到四环素、氧四环素和强力霉素的检测限LOD分别 为 5 ngmL-1、8 ngmL-1和 25 ngmL-1。Przeniosło-Siwczyńska[23]等采用 HPLC 对 353 份饲料样品进行了抗菌物质分析，其中 186 份样品中有 42 份含有未申报的四环素， 其测定浓度为 0.349 mgkg-1。 2分子印迹聚合物法 Yang[24]等合成了一种具有 pH 响应性、 磁性和核壳结构的新型分子印迹聚合物， 采用磺胺甲恶唑作为探针分子，以磁性纳米粒子为核心，2-甲基丙烯酸乙酯和 4-乙 烯基苯基溴代酸为 pH 敏感单体，以薄层印迹聚合物层为外壳，成功地应用于实际 牛奶样品中磺胺甲恶唑的选择性检测，检测样品回收率在 89.798.2之间。Lian[25] 等利用分子印迹聚合物法对卡那霉素进行痕量检测，通过采用生物电催化对样品预 处理，可以检测到 28 nmolL-1的卡那霉素。 3免疫色谱分析法 Hendrickson[26]等利用免疫色谱分析法同时测定大环内酯类和林可酰胺类抗生 素中的泰乐菌素TYL和林可霉素LIN。免疫色谱分析以一种间接的形式实现，将 第 1 章 绪论 - 3 - 与金纳米颗粒结合的抗物种抗体作为标记，10 min 内，对 TYL 和 LIN 的检测极限 分别为 0.045 ngmL-1和 0.01 ngmL-1。该免疫色谱系统可检测牛奶、蜂蜜和鸡蛋中 的 TYL 和 LIN，对食品中抗生素的回收率为 87.5112.5。 4液质联用法 Wu[27]等建立并验证了液质联用法测定牛乳中残留的杆菌肽 A、粘菌素、恩拉霉 素和弗吉尼亚霉素肽类抗生素。与溶剂标准品相比，对于杆菌肽 A、粘菌素和恩拉 霉素的平均回收率在 70120之间，而弗吉尼亚霉素残留物的平均回收率高达 138。牛奶中肽类抗生素残留的 LOD 为 0.55.5 ngg-1，远低于相关的监管水平。 Jank[28]等采用液质联用法在经过复杂的液液萃取等预处理过程后成功对牛奶中青霉 素等 14 种抗生素残留进行检测。 由此可见，上述抗生素的检测方法，虽然检测结果的准确度高，但是均需要复 杂的预处理过程且操作繁琐、检测时间较长。 随着各种新型 SERS 基底的不断出现，SERS 技术的应用领域也变得更加广泛。 SERS 简单快捷的检测方法给抗生素的检测带来了潜在的应用价值。Chen[29]等采用 两步样品预处理过程，如图 1-1 所示，用银纳米粒子组装底物对牛奶中青霉素 GPENG进行 SERS 检测，PENG 残留量 LOD 可达 10-9molL-1M，在 10-810-3M 检测范围内，存在良好的线性关系。PENG 的回收率为 7697，对应的相对标准偏 差为 4.8和 2.1，该方法可以有效地应用于牛奶中 PENG 残留量的测定。 a 银纳米颗粒的 SEM 图像b PENG SERS 检测 图 1-1 PENG 实验结果[29] Andreou[30]等利用 SERS 技术，通过优化银纳米粒子的聚集，对牛奶样品中的青 霉素进行检测，LOD 可达 10 μgmL-1。Muhammad[31]等采用电化学沉积法，以阳极 氧化铝为基材制备了无需对样品进行特殊预处理的高性能周期性银纳米阵列基底， 成功检测到浓度为 10-10M 的罗丹明 6GR6G溶液， 基底还用于检测 10-9M 和 10-7M 牛奶中低浓度的 TC 和双氰胺DCD，结果表明 TC 和 DCD 的浓度和强度之间具有 燕山大学工程硕士学位论文 - 4 - 良好的线性关系。 普通的 SERS 检测方法虽然降低了检测时间和样品的复杂处理环节，但是不能 进行远程实时检测。当检测有毒和挥发性物质时，可能会对拉曼系统的光学透镜造 成污染，对昂贵的拉曼仪器带来损伤。 1.3 光纤 SERS 探针的国内外研究现状 如何获得性能良好的光纤 SERS 探针基底是影响 SERS 信号强弱的关键。光纤 SERS 探针的结构以及其表面的贵金属纳米粒子的形貌、尺寸等都会影响其性能。 目前，基于贵金属纳米结构光纤探针的制备方法主要包括激光诱导化学沉积、溶胶 自组装、真空蒸镀以及物理磁控溅射技术。 1.3.1 激光诱导化学沉积法 柠檬酸钠与硝酸银或氯金酸的混合溶液通常为激光诱导化学沉积法LICDM中 的反应液，其中柠檬酸钠作为还原剂。将裸光纤探针放入反应液中，在激光诱导下， 反应液将发生氧化还原反应，使得银纳米颗粒沉积在裸光纤探针端。 Xu[32]等通过飞秒烧蚀光纤制备了高灵敏度的锥形 SERS 光纤探针，如图 1-2 所 示， 使用 LICDM 在锥形光纤上生长银纳米粒子。 将光纤 SERS 探针在不同还原功率 比下进行实验，SERS 信号最强时的还原功率比为 60，光纤 SERS 探针对 R6G 溶 液的 LOD 低至 10-9M。 图 1-2 LICDM 和光纤 SERS 探针检测的实验装置[32] Yin[33]等提出了一种基于 LICDM 的 U 形光纤 SERS 探针，图 1-3 中 a所示为 U 形光纤 SERS 探针的扫描电子显微镜SEM图像。以 R6G 为探针分子，成功检测到 10-8M 的 R6G，实验表明随着 U 形宽度的增加，SERS 信号急剧下降，当 U 形结构 宽度为 12 μm 时，其灵敏度比单端光纤 SERS 探针提高了四倍。Yin[34]等提出了一种 第 1 章 绪论 - 5 - 基于飞秒激光烧蚀和 LICDM 的新型 D 形光纤 SERS 探针，图 1-3 中 b所示为 D 形 光纤 SERS 探针。 以 R6G 为探针分子， 实验结果发现 R6G 分子的 SERS 信号随着激 光烧蚀 D 形区长度的增加而增强。D 形光纤 SERS 探针为生化分析中的 SERS 信号 的高性能以及实时和远程测量提供了一种可行方法。 a U 形[33]b D 形[34] 图 1-3 不同形状光纤 SERS 探针