耐低pH氧化亚铁硫杆菌的培养与驯化.pdf

3 0 有色金属 冶炼部分 2 0 0 7 年4 期 耐低pH 氧化亚铁硫杆菌的培养与驯化 郑志宏，吴为荣，李寻，刘亚洁，张卫民 东华理工大学，江西抚州3 4 4 0 0 0 摘要采用9 K 培养基从沙洲坝铀矿石中分离出一株耐低p H p H 1 ．6 的氧化亚铁硫杆菌 B 1 6 ，经多 次驯化，它可以适应矿石培养基和矿石酸化液。从而证实，用矿石酸化液替代9 K 培养基培养氧化皿铁 硫杆菌是可行的。 关键词氧化．亚铁硫杆菌；p H ；矿石；培养基；酸化液 中图分类号Q 9 3 3 3 5文献标识码A文章编号1 0 0 7 7 5 4 5 2 0 0 7 0 4 一0 0 3 0 一0 3 C u l t i v a t i n ga n dD o m e s t i c a t i n go nT h i o b a c i l l u sF e r r o o x i d a n su n d e rL o wp H Z H E N GZ h i h o n g ，W UW e i r o n g ，L IX u n ，L I UY a - j i e ，Z H A N GW e i m i n E a s tC h i n aI n s t i t u t eo fT e c h n o l o g y ，F u z h o u ，J i a n g x i3 4 4 0 0 0 ，C h i n a A b s t r a c t T h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s B 1 6 ，t o l e r a t i n gl o wp H p H 一1 ．6 ，i ss e p a r a t e df r o mS h a z h o u b au r a n i u mo r eb yu t i l i z i n g9Kc u l t u r em e d i u ma n dt h e ni sr e p e a t e d l yd o m e s t i c a t e d ，t h a tB 16c a na d a p to r ec u l t u r em e d i u ma n da c i d i f i c a t i o nl i q u i d , T h e r e b yi t i sc o n f i r m e dt h a tc u l t i v a t i n gt h i o b a c i l l U Sf e r r o o x i d a n si s f e a s i b l eb yo r ea c i d i f i c a t i o nl i q u i di n s t e a do f9 Kc u l t u r em e d i u m ． K e y w o r d s T h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ；p H ；O r e ；C u l t u r em e d i u m ；A c i d i f i c a t i o ns o l u t i o n 迄今为止，用于微生物冶金的细菌已经发现了 2 0 多种n ] ，常用的浸矿细菌主要是硫杆菌属和嗜酸 热细菌两类。其中，氧化亚铁硫杆菌 T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ，缩写为T ．f 的应用研究最为多见[ 2 ] ， T ．f 菌浸铀即为其一[ 3 _ 6 ] 。T ．f 菌的生长p H 范围 为1 ．2 ～6 ．0 ，而最佳p H 范围为2 ．5 ～2 ．8 [ 7 ] 。但对 于含有大量耗酸物质的铀矿石而言，为减少浸铀过 程中铁矾的沉淀，就必须使浸矿环境p H 1 ．6 ，相 应地，T ．f 菌必须耐低pH [ 8 | ，需要采用紫外线诱 变Ⅲ或定向富集分离驯化‘9 3 等方法得到这类耐酸菌 株。本文即是采用9 K 培养基定向富集分离，不断 添加矿石培养基和矿石酸化液转代驯化的方法获得 耐P H 一1 ．6 的浸铀T ．f 菌。 1 材料与方法 1 ．1 9 K 培养基的配制 分离用9 K 培养基的基本成分为 N H 。 S O ；、 作者简介郑志宏， 1 9 7 6 - - ，男，内蒙古乌兰察布人，讲师，硕士 K C l 、K 2H P O 。、M g S 0 4 7 H z O 、C a N 0 3 2 ，其质量 浓度分别为 g ／L 3 ．0 0 、0 ．1 0 、0 ．5 0 、0 ．5 0 、0 ．0 1 ； F e S O 。7 H O 质量浓度为2 5g ／L ，折合F e 2 浓度 为5g ／L 。具体配制方法是将9 K 培养基的各种试 剂用电子天平精确称取后按顺序溶人7 0 0m L 自来 水中 每种试剂必须完全溶解后才能继续加入下一 试剂 ，在1 2 0 ℃、1 0 0P a 条件下灭菌3 0m i n a 液 。 再按要求将F e S O 。7 H 2 0 加入含1m L1 0m o l ／L 硫酸的3 0 0m L 无菌水中溶解 b 液 。然后将a 、b 两液无菌混合后用浓硫酸调节p H 到1 ．6 。 1 ．2 矿石培养基及酸化液的制备 所谓矿石培养基是指从待浸铀矿中缩分取出一 部分，用8g ／L 硫酸酸化，酸化到p H 1 ．6 为止 2 4 h 内不超过1 ．6 ，酸化后的矿石作为驯化T ．f 菌的 一部分原料，故将其称为矿石培养基 粒度小于5 m m 。而酸化浸出的溶液则为矿石酸化液，其化学 成分与原来的硫酸相比有了很大的不同，其中因溶 万方数据 有色金属 冶炼部分 2 0 0 7 年4 期 3 1 滤矿石中的各种成分而富含许多T ．f 菌生长所需 的营养和能源，如N H 。 、K 、P O ] 一、M g 抖、C a 2 和 F e 2 等。使用前，为避免矿石酸化液中对T ．f 菌生 长起抑制作用的离子浓度太高，需要对其进行适度 的稀释。 1 ．3T ．f 菌的分离、驯化方法 在无菌条件下将采自7 2 1 矿沙洲坝的微生物铀 矿样破碎为小于5m m 的颗粒，取2 0g 放人2 5 0m L 锥形瓶中，然后加入按上述方法配制的9 K 培养基 1 0 0m L ，塞上无菌棉塞，置人温度为3 0 ℃、转速为 9 0r ／m i n 的恒温培养箱中振荡培养，并随时观察其 变化情况。当p H 升高时，补加硫酸维持其p H 一 1 ．6 ；当颜色开始变化时，则开始监测其F e 2 、F e 3 浓度变化。直到溶液颜色变红，且其中的F e 2 氧化 率达到8 0 ％以上时，认为T ．f 菌富集分离成功，得 到编号为B 1 6 的T ．f 菌一株，然后对其进行转代驯 化。 转代驯化的方法是，将前一代菌液 每次均取其 上清液 编号为A 、9 K 培养基 编号为B 、矿石酸 化液 编号为C 按比例 见表1 加入锥形瓶，然后 再视情况添加矿石培养基 每次接种时，均将上次接 种液中的矿石培养基保留，即在按比例取菌液时，把 矿石也一并加入新的锥形瓶中接种 ，在温度3 0 ℃、 p H 1 ．6 条件下，置于转速为9 0r ／m i n 恒温培养箱 中振荡培养至活性期。 表1 接种统计表 T a b l e 】T h es t a t i s t i c so fi n o c u l a t i o n 阶段接种代数接种比例 A B c 加矿量／g 总矿量／g 分离阶段 10 1 0 0 02 02 0 22 0 8 0 002 0 32 0 8 0 02 04 0 4Z 0 6 0 2 004 0 驯化阶段 52 0 2 0 6 004 0 61 0 1 0 8 02 0。6 0 71 0 1 0 8 006 0 2 试验结果及分析 2 ．1B 1 6 富集分离结果 图1 从图1 可以看出，B 1 6 初次接种后，经历了大约 1 0 天之后，溶液中的F e 2 和F e 3 才开始发生明显 变化，第1 0 天到第1 4 天则是T ．f 菌发育的对数增 长期，其生长呈直线上升式，变化异常迅速。到溶液 中的F e 2 降低为0 ．2 5g ／L 时则再次接种。另外， 图中出现了F e 2 浓度大幅上升的现象，最大浓度高 达9 ．5g ／L ，而且溶液中的F e 件最大浓度也达到了 9 ．5g ／L 。而实际上，最初接种时的F e 2 浓度为5 ．4 g ／L ，很明显有铁总量的增加。分析认为，是由于矿 石中黄铁矿被大量氧化溶解出来形成的。而其中的 个别数值波动则是人为测试的误差导致的。 f 一 ’∞ 显 ， 去 出 6 时I 明，天 图1B 1 6 富集分离阶段F e 2 、F e 3 浓度 F i g ．1 T h ec o n c e n t r a t i o no fF e 2 a n d F e S a tt h ee n r i c h m e n ts e p a r a t i o n s t a g eo fB 1 6 为了评价T ．f 菌发育速度的快慢，我们以F e 2 氧化率作为评判指标。若以初始和最终F e 2 浓度 计算F e 2 氧化率，则为0 ．0 1 5g ／ L h ，若以最高 F e 3 浓度计算F e 2 氧化率，则为0 ．0 2 8g ／ L h 。 2 ．1B 1 6 驯化结果 由表1 可知，从分离阶段到驯化阶段，每次接种 的条件都有变化。．第1 次接种时 分离阶段 ，是将 2 0g 矿石 第1 次接种是微生物矿样，并非矿石培养 基 浸泡在1 0 0m L 的9 K 培养基中进行的。经过 1 4 天的连续培养，T ．f 菌在其中逐渐生长发育起 来，使培养基中的F e 2 浓度逐渐下降直到再次接 种，其F e 2 氧化率为0 ．0 1 5g ／ L h 见图1 ，以初 始和最终F e 2 浓度计算，以下同 ；随后再取其2 0 m L 上清夜接种到8 0m L 的9 K 培养基中培养，仅 经过3 天左右，就再次发育到对数期，其F e 2 氧化 率为0 ．0 5 0 8g ／ L h ，是第1 次接种分离时的3 倍多。说明T ．f 菌对该环境的适应性逐渐增强 该 环境条件为p H - - - - 1 ．6 0 、2 0g 矿石 。 第3 次接种时，在第2 次接种条件的基础上再 加入2 0g 矿石培养基，使接种溶液中的矿石量达到 4 0g 之后，继续培养。本次T ．f 菌对F e 2 的氧化率 为0 ．0 5 1 4g ／ L h ，基本与第2 次接种时相同。 在第4 、5 次接种时，不再额外添加矿石培养基，仅是 将前次溶液中的矿石保留在本次接种液中，而接种 溶液中的A 、B 、C 液的比例发生变化，其中第4 次为 2 0 6 0 2 0 ，第5 次为2 0 2 0 6 0 。结果发现T ．f 菌对F e 2 的氧化率不但没有降低，反而逐渐上升， X K X X X K K X K X X O 9 8 7 6 S 4 3 2 l O 万方数据 3 2 有色金属 冶炼部分 2 0 0 7 年4 期 分别为0 ．0 8 3g ／ L h 和0 ．1 0g ／ L h 。由此可 以初步判断，T ．f 菌对酸化液的适应性较强，在矿石 总量没有发生变化的情况下，接种液中酸化液的增 加和9 K 培养基的减少并没有影响到T ．f 菌的快速 发育。说明酸化液中富含T ．f 菌生长发育所需的 各种营养物质和能源。因此，可以使用矿石酸化液 来替代大部分9 K 培养基，从而减少各种化学试剂 的投放量。若将此方法应用于工业生产，则必将降 低T ．f 菌培养成本，从而最终降低T ．f 菌浸铀成 本。 在第6 次接种时，则将接种配液比例变为1 0 1 0 8 0 ，且又在原有4 0g 矿石的基础上添加了2 0g 矿石培养基，使接种液中的矿石总量达到了6 0g ，而 溶液总体积仍旧为i 0 0m L 其中8 0m L 为酸化 液 。培养的结果是T ．f 菌发育速度有所下降，其 对F e 2 的氧化率变化为0 ．0 4 9g ／ L h ，是第5 次 的一半。分析认为，其氧化速率下降的原因有二一 是接种时原菌液量仅为1 0m L ，比前几次少1 0m L ， 使接种后溶液的初始菌密度减少，影响其快速繁殖 膨胀；二是在第5 次接种的基础上又添加了2 0g 矿 石培养基，增加了T ．f 菌适应环境的难度。但在同 样条件下，再进行第7 次接种驯化时，Ef 菌对F e 2 的氧化率则又有所上升，达到了0 ．0 6 3g ／ L h 。 这说明该菌株对这种含矿总量为6 0g 的生存环境 进一步适应了。由此可以推断，在A 、B 、C 液配比相 同的条件下，若再经过第8 、9 次的多次连续培养，该 菌株必将能适应更大量的矿石培养基环境，从而能 适应与槽浸时的固液比条件相同的环境。因此，对 该菌的驯化重点应该放在培养其适应待浸铀矿石 上，因上述接种驯化显示，矿石酸化液对T ．f 菌的 生长影响不大，它可以为T ．f 菌生长提供一定的营 养物质和能源。 1 ； 彗 室6 鞋 { 73 ． 出2 图2B 1 6 分离及驯化阶段F e 2 十、F e 3 浓度 F i g ．2 T h ec o n c e n t r a t i o no fF e 2 a n d F e 3 a tt h es e p a r a t i o na n dd o m e s t i c a t i o n s t a g eo fB 1 6 另外，由图2 中的F e 2 ． 、F e 3 变化曲线可以看 出，每次接种得到的曲线的斜率都不相同。第4 、5 次接种的曲线斜率更大，这与图3 中第4 、5 次接种 时F e 2 的氧化率较大是一致的。由此可以再次说 明，在矿石总量相同的情况下，仅改变接种溶液中的 A 、B 、C 液的比例，T ．f 菌是很容易适应的，用矿石 酸化液来替代9 K 培养基是可行的。 f 号 T 翌 婚 晕 跖 高 墨 接种次数 图3B 1 6 分离及驯化阶段F e 2 氧化率 F i g ．3 T h eo x i d a t i o nr a t eo fF e 2 a tt h e s e p a r a t i o ha n dd o m e s t i c a t i o ns t a g eo fB 1 6 3结论 1 T ．f 菌对环境的适应是逐步的，在一定条件 下，可以采用多次转代驯化的方式得到试验所需的 T ．f 茵。 2 用矿石酸化液替代9 K 培养基进行T ．f 菌 的培养是可行且经济的。 参考文献 [ 1 ] 陈顺方，钟文远．应用细菌浸出技术回收利用低品位铜 矿资源[ J ] ．湿法冶金，1 9 9 9 2 5 8 ． [ 2 ] 周吉奎，钮因键．硫化矿生物冶金研究进展[ J ] ．金属矿 山，2 0 0 5 4 2 4 3 0 ． [ 3 ] 刘健，樊保团，张传敬．抚州铀矿细菌堆浸半工业试验研 究E J - 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