依托咪酯后处理肢体缺血再灌注肺损伤模型大鼠Fas_Fasl通路的变化.pdf

中国组织工程研究 Chinese Journal of Tissue Engineering Research 文章编号2095-4344202032-05162-06 5162 www.CJTER.com 研究原著 邹海波，1981 年生，辽宁 省沈阳市人，汉族，2008 年中国医科大学毕业，硕 士，副主任医师，主要从 事器官缺血再灌注损伤与 防护研究。 通讯作者孙晓峰，博士， 主任医师，沈阳医学院附 属中心医院，辽宁省沈阳 市 110000 文献标识码B 投稿日期2019-11-19 送审日期2019-11-22 采用日期2020-01-22 在线日期2020-05-30 Zou Haibo, Master, Associate chief physician, Affiliated Central Hospital, Shenyang Medical College, Shenyang 110000, Liaoning Province, China Corresponding author Sun Xiaofeng, MD, Chief physician, Affiliated Central Hospital, Shenyang Medical College, Shenyang 110000, Liaoning Province, China 依托咪酯后处理肢体缺血再灌注肺损伤模型大鼠Fas/Fasl通路的变化 邹海波，孙晓峰沈阳医学院附属中心医院，辽宁省沈阳市 110000 DOI10.3969/j.issn.2095-4344.2865 ORCID 0000-0002-8442-8113邹海波 文章快速阅读 文题释义 依托咪酯依托咪酯作为催眠性静脉全麻药，属于咪唑类衍生物，安全性高，全身麻醉诱导时呼吸和循环 功能抑制作用比较轻微。 依托咪酯发挥再灌注损伤保护作用的机制， 可能与激活了细胞膜上的 GABA 受体， 使细胞膜对 Cl -通透性增加，从而形成 Cl-平衡电位，从膜电位水平对缺血再灌注诱发的细胞膜去极化。 Fas/FaslFasL 是可以与死亡受体 TNFRSF6/FAS 结合的细胞因子，在 T 淋巴细胞发育进程中介导细胞毒 性诱导的细胞凋亡。Fas 及其配体 FasL 是近年来研究得最为透彻的与细胞凋亡相关的膜表面分子，也是研 究细胞凋亡的新靶点，对进一步了解细胞凋亡的发生机制起到了意义深远的影响。 摘要 背景目前文献已证实依托咪酯预处理可减轻肢体缺血再灌注对远隔脏器造成的损伤，但依托咪酯后处理 对肢体缺血再灌注对远隔脏器是否有保护作用及其机制，目前报道甚少。 目的观察依托咪酯后处理对肢体缺血再灌注肺损伤的影响。 方法将大鼠采用夹闭双侧股动脉 2 h、再灌注 3 h 的方法制备肢体缺血再灌注肺损伤模型，设为模型组； 于大鼠肢体缺血 2 h 后，经尾静脉分别注射依托咪酯 1.0 mg/kg 或地塞米松 0.2，0.5 和 1.0 mg/kg，分别设 为依托咪酯后处理组、地塞米松 0.2，0.5，1.0 mg/kg 组。各组于再灌注 3 h 时经颈动脉取血，行动脉血气 分析，记录血氧分压。随后取大鼠肺组织采用免疫组织化学染色检测病理变化、应用 Hoechst33258 染色 法检测肺细胞凋亡指数以及检测肺湿/干质量比；应用 Westen Blot 法和 RT-PCR 法分别测定肺组织 Fas 蛋白和 Fasl mRNA 的表达；采用 ELISA 法测定肺组织肿瘤坏死因子 α 及白细胞介素 1β 水平。 结果与结论 ①与模型组比较， 在依托咪酯后处理组中血氧分压升高P 0.05， 凋亡指数、 肺湿/干质量比、 Fas 和 Fasl mRNA 表达、肿瘤坏死因子 α 及白细胞介素 1β 蛋白表达下降，凋亡坏死的病灶数量减少P 0.05；③上述结果证实，依托咪酯后处理可降低大鼠肢体缺血再灌注导致的肺损 伤，其机制可能与下调 Fas/Fasl 有关；在统计学角度上，依托咪酯 1.0 mg/kg 降低肺损伤的效价强度，几 乎相当于地塞米松 0.5 mg/kg。 关键词 依托咪酯；后处理；缺血再灌注；肺；Fas；Fasl；凋亡指数；氧分压；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β； 大鼠 中图分类号R459.9；R363；R364 结论 1依托咪酯后处理可以降低大鼠肢体缺血再灌注导致的肺损伤， 其机制可能与下调依托咪酯后处理可以降低大鼠肢体缺血再灌注导致的肺损伤， 其机制可能与下调 Fas/FasL 表达表达 有关有关； 2从从统计学角度统计学角度观察观察， 依托咪酯， 依托咪酯 1.0 mg/kg 降低肺损伤的效价强度几乎相当于地塞米松降低肺损伤的效价强度几乎相当于地塞米松 0.5 mg/kg。 文章特点 1依托咪酯后处依托咪酯后处 理的实验设计理的实验设计 是是目前该领域目前该领域 实验性研究的实验性研究的 一个创新性亮一个创新性亮 点点； 2以往文献研究以往文献研究 靶点绝大多数靶点绝大多数 都锚定于预处都锚定于预处 理， 预处理实验理， 预处理实验 干预的时间点干预的时间点 可控性相对容可控性相对容 易掌握， 而后处易掌握， 而后处 理的实验干预理的实验干预 时间点必须经时间点必须经 过多次预实验过多次预实验 尝试才能最终尝试才能最终 设定设定。 假手术组 只进行手术，只进行手术， 不不 进 行进 行 肢 体肢 体 缺 血 再 灌注缺 血 再 灌注 造模处理造模处理。。 模型组 采用肢体采用肢体 缺血再灌缺血再灌 注肺损伤注肺损伤 造模处理造模处理。。 依托咪酯后处理组 采用肢体缺血再采用肢体缺血再 灌注造模处理， 并灌注造模处理， 并 给予依托咪酯给予依托咪酯。。 地塞米松组 采用肢体缺采用肢体缺 血再灌注造血再灌注造 模处理， 并给模处理， 并给 予地塞米松予地塞米松。。 肺 组 织 免 疫 组 织 化 学 染 色切片 肺组织细胞 凋亡 肺组织 Fas 蛋白 表达 肺 组 织Fasl mRNA 表达 ZOU HB, SUN XF. Variation of Fas/Fasl pathway in limb ischemia-reperfusion lung injury rats after etomidate post-treatment. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24325162-5167. DOI10.3969/j.issn.2095-4344.2865 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CJTER.com 5163 基金资助 辽宁省自然科学基金项目20180550621，项目负责人孙晓峰；辽宁省教育厅一般项目L2015540，项目负责人孙晓峰；沈阳医学 院青年基金项目20162029，20191013，项目负责人邹海波 Variation of Fas/Fasl pathway in limb ischemia-reperfusion lung injury rats after etomidate post-treatment Zou Haibo, Sun Xiaofeng Affiliated Central Hospital, Shenyang Medical College, Shenyang 110000, Liaoning Province, China Abstract BACKGROUND To date, it has been confirmed that etomidate pre-treatment can reduce the damage of remote organs caused by limb ischemia-reperfusion, but whether etomidate post-treatment has protective effect on remote organs and its mechanism has been rarely reported. OBJECTIVE To investigate the influence of etomidate post-treatment on limb ischemia-reperfusion lung injury. S A rat model of limb ischemia-reperfusion lung injury was prepared by clamping the bilateral femoral arteries for 2 hours and reperfusion for 3 hours. After 2 hours of limb ischemia, I/R group experienced the process of limb ischemia-reperfusion; I/RETO group, I/RDex 0.2 group, I/RDex 0.5 group and I/RDex 1.0 group, besides the model of limb ischemia-reperfusion, were injected with etomidate 1.0 mg/kg and dexamethasone 0.2, 0.5 and 1.0 mg/kg respectively through tail vein. At 3 hours of reperfusion, blood samples were extracted from the carotid artery, blood gas analysis was pered and the partial pressure of blood oxygen PaO2 was recorded. The pathological changes were detected by immunohistochemistry. Apoptotic index was detected by Hoechst 33258 staining and wet/dry weight ratio was detected. Fas protein and Fasl mRNA of lung tissue were detected by western blot and RT-PCR respectively. Tumor necrosis factor-α and interleukin-1β levels were detected by ELISA. RESULTS AND CONCLUSION Compared with the I/R group, PaO2 increased P 0.05, Apoptotic index, wet/dry weight ratio, Fas and FasL mRNA, tumor necrosis factor-α and interleukin-1β decreased in the I/RETO group, and the number of apoptotic lesions decreased in the I/RETO group P 0.05. To conclude, etomidate post-treatment can reduce lung injury caused by limb ischemia-reperfusion in rats, and its mechanism may be related to the down-regulation of Fas/FasL. In the statistical point of view, etomidate 1.0 mg/kg has the potency intensity of reducing lung injury, almost equivalent to dexamethasone 0.5 mg/kg. Key words etomidate; post-treatment; ischemia-reperfusion; lung; Fas; FasL; apoptotic index; PaO2; tumor necrosis factor-α; interleukin-1β; rat Funding the Liaoning Provincial Science and Technology Plan, No. 20180550621 to SXF; the General Project of Liaoning Provincial Education Department, No. L2015540 to SXF; the Youth Foundation of Shenyang Medical College, No. 20162029 and 20191013 both to ZHB 0 引言 Introduction 肢体缺血再灌注肺损伤是目前临床工作中非常热议的 话题。随着对缺血再灌注领域的深入研究，发现除了缺血 再灌注的脏器本身被损伤外，其远隔脏器也可能受累。有 研究表明，缺血再灌注损伤机制与复杂的信号传导通路关 系十分密切，例如前期研究证实，大鼠肢体缺血再灌注 肺损伤与MMP-9/TIMP-1信号通路和Toll-样受体4/核转录 因子κB信号通路有关等[1-2]。 在近期文献报道的诸多损伤机 制的研究中，Fas/Fasl信号通路的研究逐渐引起缺血再灌 注领域的关注，Fas及其配体FasL是近年来研究最为深入 的有关细胞凋亡的膜表面分子，阐明它们在凋亡中作用机 制，对深入了解细胞凋亡的机制产生了深远的影响[3]。有 研究表明，依托咪酯可以通过下调Fas/Fasl减轻大鼠脑缺 血再灌注损伤[4]。 根据上述文献研究结果可以猜想，依托咪酯是否通过 Fas/Fasl影响肺损伤，目前在该领域还没有相关报道。实 验以大鼠为研究对象，探讨依托咪酯后处理对肢体缺血再 灌注肺损伤影响。 1 材料和方法 Materials and s 1.1 设计 随机对照动物实验。 1.2 时间及地点 于2019年1月在沈阳医学院附属中心 医院动物实验室完成。 1.3 材料 成年雄性6-8月龄SD大鼠180只，由中国医科 大学实验室中心提供，许可证号SYXK 辽 2018-0007， 体质量280-320 g。动物饲养室温24 1 ℃，湿度 45-55；采用透明、保温的材质制成的保温箱，以保证 饲养箱内24 h自然昼夜交替，自由饮水。 1.4 实验方法 1.4.1 分组和建模 采用随机数字表法将180只SD大鼠 分为6组n30假手术组、模型组、依托咪酯后处理组、 地塞米松0.2，0.5，1.0 mg/kg组。按参考文献[7]方法制作 大鼠肢体缺血再灌注肺损伤模型。造模前12 h禁食，自由 饮水。 腹腔注射体积分数3戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉， 右 颈外静脉置管建立静脉通路。于大鼠双后肢股三角区切开 肤，分离股动脉和股静脉，采用无创微动脉夹于近腹股沟 韧带处夹闭股动脉，使双后肢缺血2 h，随后松开无创微动 脉夹， 再灌注3 h。 应用ES-1000 SPM超声血流仪Hayashi Denki，大阪，日本监测血流，以未监测到血流为缺血成 功标志，监测到血流为再灌注成功标准。所有实验大鼠在 实验过程中静脉输注生理盐水1.5 mL/kgh以补充生理需 要量。 假手术组仅常规开腹手术以及分离股动脉和股静脉， 但不夹闭；模型组制备肢体缺血再灌注模型；依托咪酯后 处理组于缺血后2 h即刻尾静脉注射依托咪酯江苏恩华股 份有限公司，徐州，中国1.0 mg/kg稀释在2 mL生理盐水 中，再灌注3 h；地塞米松0.2，0.5，1.0组于缺血后2 h即 邹海波，孙晓峰. 依托咪酯后处理肢体缺血再灌注肺损伤模型大鼠Fas/Fasl通路的变化[J]. 中国组织工程研究，2020，24325162-5167. DOI10.3969/j.issn.2095-4344.2865 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN ZLKHAH 5164 刻尾静脉分别注射地塞米松 0.2，0.5，1.0 mg/kg均稀释 在2 mL生理盐水中；其他各组以等量生理盐水2 mL经尾 静脉注射替代。 1.4.2 血气分析 于大鼠肢体再灌注3 h时即刻颈动脉取 血3 mL，应用Gem Premier3000型血气分析仪南京利艾 成贸易有限公司，南京，中国立即行动脉血气分析，并记 录血氧分压。随后麻醉处死大鼠。 1.4.3 大鼠肺组织生化指标及湿/干质量比的检测 采用 ELISA法检测肺组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水 平。于大鼠肢体再灌注3 h时取左肺上极组织1 cm3，制成 10肺组织匀浆，每组取5孔，将肿瘤坏死因子α标准品按 倍比梯度稀释，然后分别加入检测孔100 μL /孔。收集上 清液，依次加入带测孔100 μL/孔，封板，37 ℃温箱避光 孵育2 h。洗涤，加入生物素化抗体工作液100 μL/孔，封 板，室温孵育1 h。洗涤。加入HRP工作液100 μL/孔，室 温孵育20 min。洗涤，加入显色剂100 μL/孔，避光孵育 20 min。加入终止液50 μL/孔，轻轻摇匀后置于酶标仪上 测450 nm处吸光度值作为测量值。计算与空白孔吸光度 值，并取平均值作为测量值，采用Curve Expert软件做出 标准曲线，并输入相应的吸光度值计算出肿瘤坏死因子α 及白细胞介素1β浓度。 取右肺下极组织1 cm3， 用4 ℃生理盐水冲洗， 去除残 留血液， 再用滤纸吸干表面水分后测量湿质量W， 随后将 肺组织样本放置于80 ℃环境下烘干48 h， 测量干质量D， 最终计算肺湿质量/干质量比值W/D。 1.4.4 免疫组织化学染色 取右肺中极肺组织1 cm3，采 用SABC法，实验步骤按试剂盒说明书进行，二抗在室温 37 ℃孵育30 min， 一抗在室温37 ℃孵育60 min一抗、 二抗；Santa Cruz，美国，DAB显色。应用BX-41型显微 镜Olympus， 日本进行镜检， 胞浆着色呈棕黄色者为阳性 表达的坏死细胞，观察坏死细胞形态。 1.4.5 Hoechst 33258染色 取右肺上极肺组织1 cm3， 常 规包埋、切片，应用磷酸盐缓冲液进行洗涤；随后添加 Hoechst 33258染色液0.5 mL，染色5 min后再用磷酸盐缓 冲液重新进行洗涤；将切片放置于载玻片，添加抗淬灭封 固液，封盖玻片，在200倍视野荧光显微镜下观察。镜下 可观察到正常细胞核呈椭圆形或类圆形、颜色呈暗蓝色； 而凋亡细胞的染色质发生固缩，细胞核呈散在的致密浓染 或呈碎块状致密浓染，镜下可见发亮、变白。每张切片随 机取5个视野，每个视野计数100个细胞。以凋亡细胞数占 肺细胞总数的比例作为凋亡指数Apoptotic Index，AI，表 示肺细胞凋亡情况。 1.4.6 Western Blot检测 采用Western Blot法检测肺组 织Fas蛋白表达。取右肺下极肺组织1 cm3，用4 ℃生理盐 水冲去残血，滤纸吸干水分，制备10组织匀浆，离心提 取总蛋白，应用DYY-6B型电泳仪北京六一仪表厂，中国 进行蛋白测定。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转模、 封闭后，分别加入兔抗大鼠Fas蛋白多克隆抗体Santa Cruz，美国、兔抗大鼠β-actin多克隆抗体Santa Cruz， 4 ℃孵育过夜；加入碱性磷酸酶标记二抗1∶2 000Santa Cruz，室温孵育2 h，酶法显色，扫描。采用Scion Image 图像分析系统分析，目的产物与β-actin灰度值的比值分别 反映Fas蛋白表达水平。 1.4.7 反转录-聚合酶链反应RT-PCR检测 应用PCR 扩增仪Biometra，德国检测肺组织中Fasl mRNA的表达 取左肺下极1 cm3制备10肺组织匀浆，Trizol法Invitrogen， 美国抽提总RNA，反转录合成cDNA，然后应用PCR扩增 仪进行扩增，Fasl mRNA引物[宝生物工程大连有限公司] 序列如表表1。Fasl mRNA反应条件94 ℃预变性2 min； 95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 延伸5 min。β-actin反应条件94 ℃预变性2 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸 5 min。扩增产物经2琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，凝 胶成像仪成像。 采用Scion Image图像分析系统分析仪目的 产物与β-actin灰度值的比值反映Fasl mRNA表达水平。 1.5 主要观察指标 Fas蛋白和FasL mRNA的表达。 表 1 Fasl mRNA 及其内参序列 Table 1 Expression of FasL mRNA and its internal reference sequences 基因名称 上游引物 片段长度bp Fasl 上游5’-ACG ACA GAC CAG GGA CAG C-3’ 395 下游5’-GAT CAC GCG AGG CGA CAC-3’ β-actin 上游5’-CAT CTT CGG ATA TGC CAG C-3’ 198 下游5’-GGA CCC GTA AGC TAC AGT-3’ 组织工程实验动物造模过程的相关问题 造模目的 观察依托咪酯后处理对大鼠肢体缺血再灌注肺损伤模型 Fas/Fasl 通路的影响 选择动物的条件 SD 雄性大鼠 180 只，6-8 月龄，体质量 280-320 g 模型与所研究疾病的 关系 前期研究证实大鼠肢体缺血再灌注可以造成远隔肺脏的 损伤[1-2]；另有报道证实依托咪酯可以通过调控 Fas/Fasl 通路减轻大脑缺血再灌注损伤[4] 动物来源及品系 中国医科大学动物实验中心 造模技术描述 利用夹闭大鼠双侧股动脉， 并用血流检测仪检测血流是否完 全阻断以确保缺血再灌注模型制作成功 动物数量及分组方 法 采用随机数字表法将 180 只 SD 大鼠分为 6 组n30 假 手术组、 模型组、 依托咪酯后处理组、 地塞米松 0.2， 0.5， 1.0 mg/kg 组 造模成功评价指标 利用血流监测仪检测夹闭动脉的远端无血流通过， 表明缺血 成功，放开动脉夹动脉，远端检测到血流，证明再灌注成功 造模后观察指标 ①肺组织湿质量/干质量； ②肺病理染色切片； ③Fas 蛋白和 FasL mRNA 的表达，以及炎性因子释放量等 造模后动物处理 大鼠后肢缺血再灌注肺损伤造模成功后， 在干预组给予依托 咪酯处理，并进行对比，观察依托咪酯后处理是否可以影响 肺损伤，及其影响机制 伦理委员会批准 实验方案经沈阳医学院附属中心医院实验伦理委员会批准 ZOU HB, SUN XF. Variation of Fas/Fasl pathway in limb ischemia-reperfusion lung injury rats after etomidate post-treatment. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24325162-5167. DOI10.3969/j.issn.2095-4344.2865 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CJTER.com 5165 1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行分析，正态分 布的计量资料以x _ s表示， 组间比较采用单因素方差分析和 LSD检验，P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 180只大鼠无脱落，均进入实验 结果分析。 2.2 各组肺组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β生化指 标及血氧分压的比较 与假手术组比较，模型组肿瘤坏死 因子α及白细胞介素1β水平升高， 血氧分压下降P 0.05； 与模型组比较， 依托咪酯后处理组中肿瘤坏死因子α、 白细 胞介素1β水平下降，血氧分压升高P 0.05， 而地塞米松0.2 mg/kg组和地塞米松1.0 mg/kg组中各指标 变化差异有显著性意义P 0.05，见表表2。 2.3 各组肺免疫组织化学染色形态 在光学显微镜下可 见，假手术组肺细胞条索排列整齐，肺泡内可见少量白细 胞浸润；模型组可见肺泡内有大量炎性细胞浸润，视野内 呈棕黄色浓染的坏死细胞增多；依托咪酯后处理组视野内 可见少量散在点状浓染坏死灶以及肺间质内少量炎性细胞 浸润； 在地塞米松干预的3组中， 随着地塞米松剂量的增加， 肺泡和肺间质内炎性细胞及坏死细胞逐渐减少，见图图1。 2.4 各组肺细胞Hoechst 33258染色、凋亡指数及肺湿/ 干质量比的比较 与假手术组比较，模型组凋亡指数、肺 湿/干质量比升高P 0.05；与模型组比较，依托咪酯后 处理组凋亡指数及肺湿/干质量比下降P 0.05，而地塞米松 0.2 mg/kg组中凋亡指数及肺湿/干质量比变化有显著性差 异P 0.05，见图图2及表表3。 2.5 各组肺组织Fas蛋白表达的比较 与假手术组比较， 模型组肺组织Fas蛋白升高P 0.05；与模型组比较，依 托咪酯后处理组Fas蛋白下降P 0.05，而地塞米松0.2，1.0 mg/kg组中Fas蛋白表达 变化有显著性差异P 0.05，见表表4及图图3。 2.6 各组Fasl mRNA的比较 与假手术组比较，模型组 Fasl mRNA表达明显升高P 0.05；与模型组比较，依托 咪酯后处理组Fasl mRNA表达降低P 0.05，见表4及图图4。 3 讨论 Discussion 器官缺血再灌注以及远隔脏器的损伤机制，是临床工 作中研究热议的话题。随着外科手术向微创转型，显微镜 的应用越来越频繁，清晰的术野便成为微创手术必须满足 的最基本要求[8-9]。在手足外科手术中，止血带的应用可以 很好的满足外科医生对术野清晰度的要求，但是接踵而至 的便是肢体缺血再灌注所带来的副损伤[10-11]。早期研究证 明，大鼠后肢缺血再灌注可以导致远隔的肺和肾损伤，其 损伤机制具有多样性， 目前尚无统一定论[12-13]。 Fas蛋白是 目前研究很深入的凋亡细胞的膜表面分子蛋白，在细胞凋 亡领域日趋备受瞩目[14-15]。在大鼠肢体缺血再灌注肺损伤 发生后， Fas蛋白及其配体Fasl是否参与了损伤过程， 目前 尚无相关研究报道。实验以大鼠为研究对象，深入探讨肢 体缺血再灌注肺损伤过程中，依托咪酯对Fas/Fasl的影响， 为肢体缺血再灌注损伤和保护机制领域填补空白。 表 3 各组凋亡指数及肺组织湿质量/干质量比值W/D结果比较 x _s，n30 Table 3 Comparison of apoptotic index and wet/dry weight ratio among groups 组别 凋亡指数 W/D 假手术组 35.413.12 2.40.2 模型组 57.263.03a 4.70.4a 依托咪酯后处理组 46.214.71b 2.90.2b 地塞米松 0.2 mg/kg 组 50.176.27c 3.50.3c 地塞米松 0.5 mg/kg 组 47.555.67 2.80.7 地塞米松 1.0 mg/kg 组 39.974.84c 2.10.4c 表注与假手术组比较，aP 0.05；与模型组比较，bP 0.05；与依托咪酯后 处理组 cP 0.05 表 4 各组肺组织中 Fas 蛋白和 FasL mRNA 表达比较 x _s，n30 Table 4 Comparison of Fas protein and FasL mRNA in lung tissues among groups 组别 Fas 蛋白 Fasl mRNA 假手术组 175.3213.12 0.480.05 模型组 215.6715.76a 0.870.13a 依托咪酯后处理组 158.9617.89b 0.550.03b 地塞米松 0.2 mg/kg 组 169.4314.84c 0.710.06c 地塞米松 0.5 mg/kg 组 156.3716.92 0.580.04 地塞米松 1.0 mg/kg 组 141.0716.72c 0.390.02c 表注与假手术组比较，aP 0.05；与模型组比较，bP 0.05；与依托咪酯后 处理组 cP 0.05 表 2 各组肺组织中各组肿瘤坏死因子 α、白细胞介素 1β 和血氧分 压结果比较 x _s， n30 Table 2 Comparison of tumor necrosis factor-α, interleukin-1β and partial pressure of blood oxygen in lung tissue among groups 组别 肿瘤坏死因子 α g/L 白细胞介素 1β μg/L 血氧分压 mm Hg 假手术组 1.180.09 0.310.03 943 模型组 3.270.43a 1.130.18a 754a 依托咪酯后处理组 1.830.38b 0.570.06b 903b 地塞米松 0.2 mg/kg 组 2.210.49c 0.780.03c 874c 地塞米松 0.5 mg/kg 组 1.710.35 0.610.05 912 地塞米松 1.0 mg/kg 组 0.980.21c 0.220.02c 962c 表注与假手术组比较，aP 0.05；与模型组比较，bP 0.05；与依托咪酯后 处理组比较，cP 0.05 邹海波，孙晓峰. 依托咪酯后处理肢体缺血再灌注肺损伤模型大鼠Fas/Fasl通路的变化[J]. 中国组织工程研究，2020，24325162-5167. DOI10.3969/j.issn.2095-4344.2865 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN ZLKHAH 5166 Fas/FasL信号通路是目前器官损伤领域研究的焦点。 FasL可在T淋巴细胞发育进程中，介导细胞毒性诱导的细 胞凋亡[16-17]。Fas及其配体FasL是近年来研究得最为透彻 的与细胞凋亡相关的膜表面分子，也是研究细胞凋亡的新 靶点，对进一步了解细胞凋亡的发生机制起到了意义深远 的影响[18-19]。 依托咪酯可以通过多种途径影响细胞损伤的过程。 依 托咪酯是咪唑类衍生物，安全性高，是麻醉诱导常用的药 物，对神经中枢有很强的抑制作用，但无镇痛作用，麻醉 诱导起效快，失效也快，在肝脏和血浆内可被酯酶迅速水 解而失去活性，其主要代谢产物为羧酸，单剂量使用时可 以使肾上腺对外界刺激的反应迟钝， 依托咪酯临床应用已 有30年的历史[20-21]。 有研究显示， 依托咪酯预处理可降低 大鼠全肺缺血再灌注损伤过程中促凋亡基因Bax的表达， 对肺缺血再灌注损伤有保护作用[22-23]。 依托咪酯发挥再灌 注损伤保护作用的机制，可能与激活了细胞膜上的GABA 受体，使细胞膜对Cl -通透性增加，从而形成Cl-平衡电位， 从膜电位水平对缺血再灌注诱发的细胞膜去极化[24-25]。 另外，NMDA受体和Ca2通道具有电压依赖性，细胞膜 的去极化被抑制，会导致Ca2内流趋势减弱，减少细胞 的耗氧量，因此在缺血再灌注损伤发生时，依托咪酯可以 增加细胞对缺血再灌注损伤的耐受性[26-28]。 依托咪酯广泛 应用于临床实验性研究和动物实验性研究， 有研究表明依 托咪酯可用于高血压患者手术、 冠心病非心脏手术的患者 等， 但是依托咪酯是否在大鼠肢体缺血再灌注肺损伤中发 挥保护作用，目前尚无统一定论[29-30]。 实验与其他文献报道不同之处在于，以往的文献报道 大多局限于器官本身的缺血再灌注损伤，并且多集中于肺 组织中活性氧自由基及丙二醛等自由基损伤角度指标进行 研究[31-32]，而此次实验是将研究靶点锚定于远隔脏器的损 伤，并且不固化于自由基损伤领域，扩展到Fas/Fasl信号通 路。在结果中可以观察到，与假手术组比较，模型组中 Fas/Fasl明显升高，炎性因子大量释放，而血氧分压下降， 提示大鼠肢体缺血再灌注肺损伤模型建立成功，为后续实验 奠定了造模基础，特别是Fas/Fasl的升高，可以初步推测损 伤机制很可能与Fas/Fasl有关；依托咪酯后处理组给予依托 咪酯后处理干预之后，损伤明显减轻，提示依托咪酯后处理 可以减轻大鼠肢体缺血再灌注肺损伤；进一步研究中发现， 依托咪酯后处理组抗损伤的效价强度在统计学角度几乎相 当于地塞米松0.5 mg/kg组， 两者无显著性差异。 此研究结果， 不但巩固了依托咪酯后处理对肢体缺血再灌注肺损伤的保 护作用，而且对依托咪酯后处理的保护作用进行了“量化” 。 图注图 A-E 分别为假手术组、模型组、依托咪酯后处理组、地塞 米松 0.2，0.5，1.0 mg/kg 组。图 B 可以观察到棕黄染色细胞明显多 于图 A；图 C 中可以观察到棕黄染色的细胞数量明显低于图 B；在设 立的 3 组不同剂量的地塞米松组中， 可以观察到 E 图片棕黄染色的细 胞数量大体与图 C 相当。图中箭头所示为变性坏死灶 图 1 各组肺组织免疫组织化学切片在光学显微镜下形态结构200 Figure 1 Morphological structure of lung tissue under light microscope immunohistochemical staining, 200 图注图 A-E 为假手术组、模型组、依托咪酯后处理组、地塞米松 0.2，0.5，1.0 mg/kg 组。在图 B 中可以观察到浓染的细胞呈团块状聚 集成蔟，明显多于图 A；在图 C 中细胞浓染现象明显减少，并且聚集显 现几乎消失；在设置的3