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原生质体融合技术在污水处理领域的应用 * 赵丽红尹文利刘爽 辽宁工业大学土木建筑工程学院， 辽宁 锦州 121001 摘要 利用微生物降解污水中的污染物是污水处理的重要方法之一， 然而常规的微生物处理法由于微生物本身基因的 限制处理效果有限， 利用原生质体融合技术可克服这种现象， 提高处理效果。原生质体融合技术具有能够克服微生物 种属间界限， 实现远缘杂交， 使遗传物质传递更为完善， 提高基因重组几率等优点。阐述了对原生质体融合的过程以 及在污水处理中的应用。 关键词 原生质体融合; 污水; 融合过程 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201406002 APPLICATION OF PＲOTOPLAST FUSION TECHNIQUE IN THE TＲEATMENT OF SEWAGE Zhao LihongYin WenliLiu Shuang College of Civil Engineering and Architecture，Liaoning University of Technology，Jinzhou 121001，China AbstractThe biodegradation is one of the most important s of wastewater treatment，however，the conventional treatment effect is limited by microbial gene． The use of protoplast fusion technique can overcome this phenomenon and improve effectiveness of the treatment． Protoplast fusion technique can break the species boundary of microorganisms and achieve remote cross，which makes a more perfect transfer of genetic material so as to raise the rate of gene reorganization． This paper focuses on the process of protoplast fusion and application in wastewater treatment． Keywordsprotoplast fusion;sewage;fusion process * 辽宁省教育厅科学技术研究项目 L2011097 ; 住房城乡建设部基金 项目 2010- K7- 8 。 收稿日期 2013 －08 －19 原生质体融合技术起源于 20 世纪 50 年代， 是在 Weibull 及 Eddy 等人分别利用溶壁酶得到芽孢杆菌 原生质体、 酵母菌原生质体的研究基础上发展起来的 一种新兴基因重组技术。原生质体融合又被称为体 细胞杂交， 是指细胞壁在溶壁酶的作用下脱壁后形成 原生质体， 然后在诱导剂或促融剂的作用下， 两个或 两个以上不同的细胞或原生质体相互接触、 相互融 合， 进而发生一系列的基因重组， 最后在适宜的培养 条件下得到融合子的过程。原生质体融合因基因重 组过程中不需要很多的附加条件; 能够克服微生物的 种属间界限， 实现了远缘杂交; 使遗传基因传递更为 完善， 并提高基因重组几率; 能够提高育种效率等优 点受到许多学者的关注与研究。 在工业水处理中常用的生物处理法有活性污泥 法和生物膜法， 但是这些方法由于微生物自身基因条 件的限制导致处理效果受限， 而利用原生质体融合可 以克服这种现象， 打破种属间的界限， 使不同种属的 微生物相互结合， 获得具有重组基因的融合子， 从而 可以增加微生物基因的多样性。因此可以利用原生 质体融合技术增强微生物对污染物的降解活性， 提高 处理效果。近年来原生质体融合技术广泛应用于水 处理领域， 成为各国科研工作者的研究热点。本文主 要阐述了原生质体融合的过程以及近几年在水处理 过程中的应用与发展。 1原生质体融合的过程 1. 1原生质体的制备及再生 原生质体的制备实质是利用溶解酶对细胞壁进 行酶解生化过程。在原生质体融合技术中常用的脱 壁方法有酶法、 非酶法和机械法。由于非酶法和机械 法活性低， 处理效果差， 因而未得到广泛的应用。在 实际应用中， 酶法是最有效的、 最常用的。在酶法中 4 环境工程 Environmental Engineering 使用的脱壁酶主要有蜗牛酶和溶解酶， 至于具体选用 哪种酶要依据所研究的微生物种类而定。原生质体 再生是指去除细胞壁后的原生质能够再次形成新的 细胞壁， 使细胞的形态得到完整的恢复并且能够进行 正常的生长、 分裂。原生质体再生可以通过固体培养 和液体培养两种方式完成。 细胞壁溶解和再生的过程中会受到培养方式、 培 养基成分、 菌龄、 菌体浓度、 酶系和酶的浓度、 酶解时 间等因素的影响。所以在进行原生质体融合之前， 应 该了解原生质体形成和再生的最佳条件。 1. 2原生质体融合 原生质体融合是指亲株细胞经过酶解脱壁后形 成原生质体， 这些原生质体进一步在高渗的条件下通 过诱导完成细胞质以及细胞核的融合、 基因交换、 基 因重组， 进而在适宜条件再生出细胞壁、 获得融合子。 在原生质体融合过程中诱导的方法有 PEG 融合、 电 融合和激光融合等。目前使用最广泛的是 PEG 融合。 PEG 融合过程 利用具有负极性的 PEG 分子， 与 碳水化合物、 蛋白质和水等具有正极性的物质形成氢 键， 从而在原生质体间形成分子桥， 使原生质体发生 粘连进而促使原生质体融合［1 ］。 1. 3融合子的选择 原生质体融合后， 融合子的筛选是原生质体融合 技术是否取得成功的主要影响因素。原生质体融合 前应对亲本株进行遗传标记， 以便筛选到融合子。在 融合过程中，可以利用生理特征、 营养缺陷型、 自然 的形态、 灭活原生质体、 荧光染色、 温度敏感性和抗药 性等方法进行融合子筛选， 其中营养缺陷型是最常用 而相对准确的选择手段［2 ］。 1. 4融合子的鉴定 对于筛选出来的融合子往往会含有异核体、 部分杂 合子、 部分二倍体，因此要对这些筛选出来的融合子做 进一步的鉴定。目前常用的鉴定方法有 酶活性的测 定， 菌体或孢子大小、 形态的对比， 对结构蛋白以及非基 因直接编码的次生代谢的分析， 同工酶电泳谱带的比 较， DNA 含量的对比， 对染色体稳定性的研究等 ［ 1 ］。 2原生质体融合在水处理中的应用与进展 原生质体融合技术在动植物种属间杂交育种、 农 业、 医药、 食品等方面的研究已经都取得了一定的重 大成果并且得到广泛应用。近年来也在污水处理领 域中获得重大突破。程树培、 许燕滨等人对原生质体 融合技术取得了一系列成功的例证， 为构建高效处理 特种工业废水的工程菌开辟了一条新的途径。目前 原生质体融合技术在提高脱氮性、 絮凝性、 降解有机 氯化物和有机磷等方面取得了一定突破。 程树培等人 ［3 ］研究了光合细菌与酵母菌融合处 理味精废水， 研究表明融合子在高浓度废水中呈现出 较高的合成生物量活性， 而降解去除 BOD5的性能不 及双亲或介于双亲之间。桑稳姣等人 ［4 ］研究了高效 脱氮菌原生质体融合， 实验确定了最佳原生质体融合 条件 紫外线照射时间为 60 s， PEG 浓度为 40， 促 融时间为 6 min， Ca2 浓度为 0. 015 mol/L， pH 10. 0， 研究表明这些高效脱氮菌经过原生质体融合后 脱氮效率比亲本提高了 27. 3。 陈洪雷等人 ［5 ］研究了利用原生质体融合技术构 建高效降解有机氯化物菌株， 实验中利用 Pseudomonas 和 Psathrella candolleana 菌株为亲本进行原生质体融 合， 研究表明重组菌 Xz6- 3 对废水中 PCP 的去除率为 75. 98， 比亲本降解率提高了 21. 71。张力等 人 ［6 ］利用跨界原生质体融合工程菌株处理合成制药 废水， 在处理工程中发现融合后的菌株具有高降解 性、 高絮凝性、 高适应性， 该菌株能够降解持久性有机 污染物 POPs， 并且比原土著菌处理效率有所提高， 沉 降速度快， 泥水分离效果好。 刘其友等人 ［7 ］研究利用原生质体融合技术提高 微生物的絮凝性， 将微生物絮凝剂产生菌 B- 6- 1 与高 效石油降解菌 SJ- 1 进行融合， 从所得的 67 株融合菌 株中筛选出菌株 FB- 1。实验结果表明在确定的最优 发酵条件下融合子对含油废水的 COD 去除率、 石油 类去除率均高于亲本， 其去除率分别为 39. 5、 68. 8。庄桂等人 ［8 ］研究了原生质体融合技术对氧 乐果生产废水中有机磷的去除， 他们以两株具有单纯 抗药性的突变菌株 S- 8 菌株 Str ， Kan- 和 K- 17 菌 株 Str- ， Kan 为亲本进行原生质体融合， 实验结果 表明融合子对氧乐果生产废水有机磷去除率达 78， COD 去除率达 88。 Baljit Kaur 等人 ［9 ］研究了以 Aspergillus nidulans 和 Aspergillus tubingensis 作为亲本进行原生质体融合 增加纤维素酶的产量， 研究表明原生质体融合技术是 基因操作应用的一种有效方法， 原生质体融合能够稳 定的增加纤维素酶的产量。 Sivakumar 等人 ［10 ］研究了通过原生质体融合技 术提高链霉菌产生漆酶和木质素降解酶的产量。通 过基因操作加快新陈代谢转换， 初步尝试采用标准化 5 水污染防治 Water Pollution Control 方法进行原生质体分离与再生。在实验过程中通过 融合子对木质素的降解能力和木质素降解酶的产量 过氧化物酶、 漆酶、 多酚氧化酶和粗蛋白 来鉴定融 合子。实验结果表明突变体和野生菌株比较， 原生质 体融合子 F4表现出较高的漆酶活性和较低的过氧化 物酶活性。 Wei W L 等人 ［11 ］研究利用克鲁维酵母菌与酿酒 酵母菌进行属间原生质体融合产生山梨醇。实验中 利用克鲁维酵母菌属 Y- 85 和酿酒酵母 E- 15 作为亲 本进行属间原生质体融合。亲本细胞先用 0. 1 的 EDTA 和巯基乙醇进行预处理， 然后在 30 ℃下 2 的 消解酶中消解 30 ～40 min。在最佳融合条件下， 30 的聚乙二醇 6 000 PEG- 6000 和 10 mmol/L 的 CaCl2 反应30 min， 融合频率达到2. 64 株/106亲本， 并通过 融合子与亲本的差异以及 DNA、 菊粉酶活性和山梨 醇生产力等方面进行融合子鉴定和筛选， 实验表明遗 传稳定的融合子 F27 在最佳的发酵条件下能够产生 山梨醇 0. 0487 g/mL。 Jin Z H 等人 ［12 ］研究了通过基因组重排 Genome shuffling 技术提高刺糖多孢菌产生多杀菌素的产量。 基因组重排技术是近几年新发展起来的一种微生物 育种方法， 该技术的优点是不需要事先知道供试微生 物的遗传背景也可以对其进行遗传育种， 是一种非常 高效的微生物育种方法［13 ］。实验中利用亚硝基胍和 紫外线照射菌株， 使其发生基因突变， 然后将突变菌 株进行原生质体反复融合， 经过四轮基因组重排之后 得到 高 产 菌 株 S．spinosa 4- 7， 该 菌 株 能 够 产 生 547 mg/L的多杀菌素， 其产量分别高于亲本菌株的 200. 55 和原始菌株的 436. 27。并且实验研究发 现以 S． spinosa 4- 7 菌株做多杀菌素的发酵实验， 在 168 h 能够产生 428 mg/L 的多杀菌素。 Manoj Kumar 等人 ［14 ］研究利用基因组重排技术 提高假单胞菌对多环芳香烃 PAHs 的降解能力。在 实验过程中首先利用亚硝基胍处理亲本菌株得到突 变体， 然后将突变菌株经过原生质体反复融合得到基 因重组的菌株。实验研究表明突变体 SF- IOC11- 16A， 经过原生质体反复融合后在液体培养基中表现 出对多环芳烃的降解能力显著提高， 融合子能够在 72 h 内对二苯并噻吩 DBT 降解 98， 与野生菌株 相比降解能力提高了 74， 并且能够对奈、 菲、 苯并 芘的降解能力有所提高。实验研究也表明重组菌株 能够在含有高浓度的多环芳香烃环境中生长并且对 多环芳香烃具有高效的降解能力。从该实验中可以 得出基因组重排能够成功地改善细菌对多环芳香烃 的降解能力。 Chen Z［15 ］等人研究了链霉菌通过种内原生质体 融合获得基因重组的融合子以提高阿维菌素 B 的产 量。在实验中利用具有高产阿维菌素能力的链霉菌 株 76- 05 与包含 aveD － 和 olmA － 突变的基因工程菌株 73- 12 进行种内原生质体融合， 获得两个重组菌株 F23 和 F29。实验研究表明 F23 和 F29 只能够产生 4 种阿维菌素 B， 但是不能够产生寡霉素， F23 和 F29 产生阿维菌素的量分别比亲本菌株 76- 05 高 84. 20 和 103. 45， 分别比亲本菌株 73- 12 增加 2. 66 倍和 3. 50 倍。 Xu J Z 等人 ［16 ］研究利用真姬菇和大杯伞通过原 生质体 融 合 产 生 漆 酶。漆 酶 对 雷 马 素 艳 蓝 Ｒ ＲBBＲ 、 铵盐和木质素具有一定的降解能力。利用 真姬菇和大杯伞进行原生质体融合， 通过在含有 ＲBBＲ 的 PDA 培养基中获得两个融合子 IM1 和 IIIM5， IM1 和 IIIM5 产漆酶能力很高， 分别高于 H 菇 产漆酶量的 413 倍和 395 倍， 它们的菌丝生长速率也 分别显著高于 H 菇近1. 5 倍和1. 4 倍。IM1 和 IIIM5 菌盖颜色部分与亲本相同， 但是 IM1 和 IIIM5 的生物 效率分别高于 H 菇的14. 58和10. 87。实验表明 IM1 和 IIIM5 的随机扩增多态性 DNA 虽然类似于亲 本但是也有不同于亲本的。 李凌 ［17 ］研究了光合细菌与嗜热脂肪芽孢杆菌融 合子在不同条件下降解氨氮的能力。实验研究表明 经过原生质体融合后获得的融合子在降解氨氮的过 程中对温度、 pH 和盐的浓度非常敏感， 但是光照强度 对融合子的降解能力的影响很弱; 并且在实验过程中 确定， 融合子在 60 ℃、 pH 7. 5、 盐浓度小于 3 是降 解氨氮的最适条件。 3前景展望 原生质体融合技术作为基因工程的一种有效手 段， 已经得到广泛的应用， 但是目前只是局限于 2 个 菌种的融合而没有应用到 3 个及 3 个以上的菌种。 如果能够将更多的菌株融合， 则有可能获得同时具有 多个优良性状的菌株。目前绝大数情况下也只是将 两个菌种直接融合， 如果能够在融合之前将亲本进行 一定的诱变选出诱变后稳定的、 生物性能更强的菌株 作为亲本进行融合这样可能会取得更大的突破。 原生质体融合技术实现远缘菌株的基因重组， 可 6 环境工程 Environmental Engineering 以使遗传物质传递更为完整， 与亲本菌株比较具有更 强的生物性能， 因此利用原生质体融合技术处理污水 与常规处理法相结合可取得更好的处理效果。在以 后的水处理领域中原生质体融合将会占据一定的重 要性。原生质体融合成功的例证为构建高效处理高 浓度工业污水的基因工程菌开辟一条新的途径。 参考文献 ［1］赵春苗， 徐春厚． 原生质体融合技术及在微生物育种中的应用 ［ J］． 中国微生物杂志， 2012， 24 4 379- 381. ［2］竺利红， 许豪． 原生质体融合技术及其在嗜酸乳杆菌菌种选育 中的应用［ J］． 安徽农学通报， 2009， 15 7 64- 66. ［3］程树培， 崔益斌， 王玉水， 等． 光合细菌与酵母菌跨界融合 杂 合 子发酵味精废水研究［J］ ． 环境科学学报， 1996， 16 1 66- 72. ［4］桑稳姣， 王磊， 刘真， 等． 高效脱氮菌原生质体融合条件的研究 ［ J］． 武汉理工大学学报， 2008， 30 7 84- 87. ［5］陈洪雷， 陈元彩， 詹怀宇， 等． 原生质体融合构建高效降解有机 氯化物工程菌的研究［J］ ． 造纸科学与技术， 2011， 30 6 87- 91. ［6］张力， 于洪峰， 程树培， 等． 跨界原生质体融合工程菌株改进合 成制药废水生物处理的有效性研究［ J］． 江苏环境科技， 2004， 17 4 9- 10. ［7］刘其友， 李政， 张云波， 等． 原生质体融合技术提高微生物絮凝 剂处理含油废水效果的研究［J］ ． 化学与生物工程， 2010， 27 10 69- 72. ［8］庄桂，刘云焕，贺以乐． 细胞融合高效菌株对氧乐果生产废水 中有机磷的去除［J］ ． 环境工程， 2008， 26 S1 13- 15. ［9］Baljit Kaur，Manju Sharma，Ｒohit Soni， et al．Proteome- based profiling of hypercellulase- producing strains developed through interspecific protoplast fusion between Aspergillus nidulans and Aspergillus tubingensis［ J］ ． Applied Biochemistry and Biotechnology， 2013， 169 2 393- 407 . ［ 10］Sivakumar U，Kalaichelvan G，Ｒamasamy K． Protoplast fusion in Streptomyces sp． for increased production of laccase and associated ligninolytic enzymes ［J］ ．World Journal of Microbiology ＆ Biotechnology， 2004， 20 6 563- 568. ［ 11］Wei W L，Wu K L，Qin Y，et al． Intergeneric protoplast fusion between Kluyveromyces and Saccharomyces cerevisiae- to produce sorbitol from Jerusalem artichokes［J］．Biotechnology Letters， 2001， 23 10 799- 803 . ［ 12］Jin Z H，Xu B，Lin S Z，et al． Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling［J］．Applied Biochemistry and Biotechnology， 2009， 159 3 655- 663. ［ 13］Stemmer W P C．Molecular breeding of genes，pathway and genomes by DNA shuffling［J］ ． Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic， 2002， 19 2 3- 12. ［ 14］Manoj Kumar，Mahendra Pratap Singh，Deepak Kumar Tuli． Genome shufflingofPseudomonassp．Ioca11forimproving degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons［J］ ． Advances in Microbiology， 2012 2 26- 30 . ［ 15］Chen Z，Wen J，Song Y，et al．Enhancement and selective production ofavermectinBbyrecombinantsofStreptomyces avermitilis via intraspecific protoplast fusion［J］． Chinese Science Bulletin， 2007， 52 5 616- 622. ［ 16］Xu J Z，Zhang J L，Zhang W G，et al． The novel role of fungal intracellular laccaseused to screen hybrids between Hypsizigus marmoreus and Clitocybe maxima by protoplasmic fusion［J］． World Journal of Microbiology ＆ Biotechnology， 2012， 28 8 2625- 2633. ［ 17］李凌． 对光合细菌与嗜热脂肪芽孢杆菌融合子在不同条件下降 解氨氮能力的研究［ J］ ． 烟台职业学院学报， 2011， 17 4 81- 83. 第一作者 赵丽红 1974 － ， 女， 副教授， 博士， 主要研究方向为污水生 物处理技术。zhaolh05163． com 通讯作者 尹文利 1987 － ， 女， 在读研究生， 主要研究方向为污水生 物处理技术。 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 wenzily126． com 上接第 3 页 ［3］刘金瀚，白宇，林海，等． 反硝化生物滤池用于污水深度脱氮 研究［ J］ ． 中国给水排水， 2008， 24 21 26- 29. ［4］郭俊元，杨春平，曾龙云，等． 回流比水力负荷对前置反硝化 生物滤池工艺处理污水的影响研究［J］ ． 环境科学学报，2010 8 1615- 1621. ［5］Ｒyu H D，Kim D，Lim H E，et al． Nitrogen removal from low carbon- to- nitrogen wastewater in four- stage biological aerated filter system［ J］． Process Biochemistry， 2008， 43 7 729- 735. ［6］周碧波，操家顺，徐哲明． 反硝化生物滤池的挂膜与启动［ J］ ． 环境科技， 2009 3 5- 7. ［7］Dong W Y， Zhang X B， Wang H J， et al． Enhanced denitrification with external carbon sources in a biological anoxic filter［J］ ． Water Science and Technology， 2012， 66 10 2243. ［8］Aslan S，Cakici H． Biological denitrification of drinking water in a slow sand filter［J］．Journal of Hazardous Materials，2007， 148 1 253- 258. ［9］Sakuma T， Jinsiriwanit S， Hattori T， et al． Ｒemoval of ammonia from contaminatedairinabiotricklingfilter- denitrifyingbioreactor combination system ［ J］ ． Water Ｒesearch， 2008， 42 17 4507- 4513. ［ 10］McCarthy P L，Beck L，Amant P S． Biological Denitrification of Wastewaters by Addition of Organic Materials［C］． 24th Ind Waste Conf， 1969. ［ 11］Hwang K， Song M， Kim W， et al． Effects of prolonged starvation on methanogenic population dynamics in anaerobic digestion of swine wastewater［ J］ ． Bioresource Technology， 2010， 101 1 2- 6． 第一作者 王娟 1987 － ， 女， 博士研究生， 主要研究方向为水处理技 术， 微生物燃料电池。 7 水污染防治 Water Pollution Control