小分子环境污染物的免疫检测技术及其研究进展.pdf

小分子环境污染物的免疫检测技术及其研究进展 ＊ 余若祯 何 苗 施汉昌 钱 易 清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家联合重点实验室, 北京 100084 摘要 针对小分子环境污染物免疫检测技术的现状, 介绍了免疫检测技术原理、特点和研究开发步骤。 综述了该技术 的基本检测形式、抗原的设计与合成、抗体的制备和关键技术问题以及最新技术的分类发展和应用现状 。 关键词 免疫检测 半抗原 环境污染物 ＊国家 863 青年基金项目 2002AA649160 。 1 引言 20 世纪 40 年代以来 , 人类大量使用合成有机化 学农药防治病虫害, 这些农药及其副产物中有许多属 于持久性有机物 POPs 、 “三致”物质和环境内分泌干 扰物质 EDCs 。在各类环境标准中对其残留量提出 了严格的限制浓度,对其检测方法的精度和效率提出 了更高的要求。免疫检测技术因具有特异性强、灵敏 性高、 样品通量大、 检测迅速 、 检测费用低廉等优势,近 年来在环境污染物检测领域引起了广泛的关注, 并且 展开了广泛的研究和一定范围的应用 。 2 小分子环境污染物免疫检测的原理和研究开发 2. 1 免疫检测的基本原理 免疫检测的基础是抗原-抗体之间的特异性反 应,这个可逆反应符合质量作用定律。当抗体的浓度 一定时 ,亲和力是定量, 半抗原 分析物 的总量决定 了结合半抗原和自由半抗原的关系。为此样品中结 合半抗原和自由半抗原的关系也可以确定样品中自 由半抗原的浓度 。 2. 2 免疫检测的常用检测形式 2. 2 . 1 匀相和非匀相免疫检测 免疫检测可以分为匀相免疫检测和非匀相免疫检 测。其中非匀相免疫检测中必须将结和抗原和游离抗 原分离。抗原或者抗体连接到固定相上, 在加入测定 反应结果的试剂之前, 从系统中去除未参与反应的试 剂 抗原或抗体 。虽然非匀相免疫检测时间较长,但 是信号检测相对简单, 因此反应的灵敏度和检测限都 高于匀相免疫检测。 2. 2. 2 竞争性免疫检测和非竞争性免疫检测 免疫检测可以分为夹心法和竞争法 ,其中竞争法 可以用来测定小分子物质 。未标记的待测抗原和一 定数量的标记抗原竞争数量有限的抗体特异性结合 位点 。反应达到平衡之后 ,可以检测出标记抗原的数 量。抗体结合的标记抗原数量与未标记待测抗原的 数量有关, 因此可以得到未标记待测抗原 分析物 的 浓度 。 2. 3 小分子物质免疫检测技术的研究开发步骤 小分子污染物免疫检测的开发包括以下 5 个主 要步骤 ,首先确定目标分析物, 设计并合成半抗原分 子,随后将半抗原分子连接到载体蛋白上 ,再用合成 抗原免疫动物制备抗体, 最终建立目标分析物的免疫 检测方法。其中制备小分子环境污染物的完全抗原 是环境污染物免疫检测技术研究中的关键问题。 3 小分子环境污染物完全抗原的制备 小分子环境污染物因为分子量小 、 结构简单, 没 有免疫原性 ,但是能与相应的抗体发生特异性结合反 应,称作半抗原 。这些半抗原和具有免疫原性的载体 carrier 结合后 ,才能刺激机体产生其特异性的抗体。 大分子载体有蛋白和纤维蛋白 、 非蛋白质载体脂质体 或葡聚糖。 半抗原的设计与合成是制备完全抗原的关键步 骤。通常, 需要给目标分析物引入一些重要的官能团 使之成为半抗原。载体蛋白用于结合半抗原的功能 基团是羧基 、 氨基、组氨酸的咪唑基和酪氨酸的羟基 以及半胱氨酸的巯基 。半抗原和载体蛋白通过共价 键偶联,成为完全抗原。大多数情况下 , 功能性偶联 发生在3～ 6个原子的 C 链烷烃的末端 , 使半抗原分 子呈现在载体分子表面, 避免被载体分子所掩蔽。远 离载体大分子表面的小分子半抗原能够更好地刺激 免疫系统产生相应的抗体 。 确定半抗原-载体复合物的结构可以初步评价完 全抗原的性能。经过化学偶联, 可以对半抗原-载体 69 环 境 工 程 2005年 6 月第23 卷第3 期 复合物的结构进行检测。通常 ,半抗原基团有一个吸 收谱带和载体蛋白相区别 。在偶联过程中掺入一些 放射性半抗原可以直接进行定量分析 。也可以将自 由氨基数量的变化作为偶联的结果进行定量。目前 应用基质辅助紫外激光吸收 离子化质谱仪 matrix- assistedultravioletlaserdesorption ionizationmass spectrometry, MALDI- MS和 电喷 雾 离 子 化质 谱 仪 electrospray ionization mass spectrometry , ESI- MS 。应 用最小能量分子模型方法设计半抗原能够选择最佳 的衍生和偶联方法, 成功地制备抗体。 4 抗体的分类及其制备 免疫实验动物获得的多克隆抗体 polyclonal 是 环境免疫检测方法中最常用的 类抗体 。而单克隆 抗体的亲和性能稳定、抗体具有同一性 , 这项技术逐 渐被广泛应用 。现在, 基因工程抗 体 recombinant antibody 生产成本低 , 对分析物的检测性能可能较 好,周期短 ,不需要难度较大的杂交瘤细胞技术。 4. 1 多克隆抗体 给动物注射半抗原-载体复合物, 可以引起动物 的免疫反应。半抗原-载体复合物有多种结合位点, 免疫系统将会产生具有不同特异性的多种抗体 称为 多克隆抗体 。多克隆抗体包含不同种类的抗体, 所 以在免疫检测使用之前抗体必须标准化 。在制备多 克隆抗体时,用于免疫动物的半抗原-载体复合物纯 度应尽可能高 。多克隆抗体因为生产成本低 、耗时 短,所以是免疫检测中常用的试剂 。 4. 2 单克隆抗体 用聚乙二醇 polyethylene glycol , PEG 处理 , 融合 能够 生 成 抗 体 的 淋 巴 B 细 胞 和 骨 髓 瘤 细 胞 myeloma , 产生的杂交瘤细胞也可以生成抗体 单克隆抗体。淋巴 B 细胞具有特异性, 骨髓瘤细胞 不会死亡 ,杂交瘤细胞具有它们的双重特性。单克隆 抗体是性质均一的, 广泛应用于医疗免疫检测中。因 为免疫检测的质量控制需要大量性质均一的抗体 ,所 以环境分析方面对单克隆抗体越来越重视。 4. 3 基因工程抗体 DNA重组技术从生物体分离编码抗体的基因, 经过纯化 ,导入另一种生物体 。带有完整的抗体结合 性能的抗体片段, 可以在 Escherichia Coli 这样易于生 长的生物体内表达, 并且大量生产 。运用分子生物学 的有力工具,可以调控抗体的结合位点 ,使其特异性、 亲和性更好。目前还不能很快地提供基因工程抗体。 运用基因工程技术有可能提高抗体的各项性能,成为 当前小分子有机污染物免疫检测的一个研究热点 。 5 基于标记物的免疫检测技术 因为在分析过程中结合待测抗原的数值无法直 接测定,在竞争性免疫检测中就必须引入标记物。标 记物是以共价键和一个可以产生信号的物质相连接 的半抗原。同时 ,必须保证标记抗原的基本免疫化学 特性 ,特别是它和抗体表面结合位点相关的结构没有 改变 。标记物可以是放射性同位素 、 酶、脂质体、 荧光 物质 、 化学发光物质等。 5. 1 放射免疫检测 主要技术包括竞争性结合放射免疫技术 RIA 、 免疫放射 分析 技术 IRMA 和 亲近 闪烁 分 析法 scintillation proximity assay , 缩写 SPA 。常用的标记 性同位素是 I 125 。早期的环境小分子有机物免疫检测 技术应用这一技术,D. Fatori 等采用放射免疫检测测 定百草枯 paraquat 。J. L . Langone 等采用放射免疫检 测测定狄氏剂和艾氏剂。 5. 2 酶免疫检测 酶免疫技术是最常见的免疫检测手段。将酶标 记在抗体或抗原分子上, 形成酶标抗体或酶标抗原, 称为酶结合物。在抗原与抗体反应形成复合物之后, 酶结合物上的酶 ,使底物显色 ,根据反应有无颜色 、 和 颜色的深浅 ,定性或定量抗体或抗原 。酶联免疫吸附 试验 ELISA 、 酶检测免疫测试 EMIT 、竞争性结合 酶免疫检测 EIA 以及免疫酶分析技术 IEMA 是常 见的检测方法。标记酶有过氧化物酶、 半乳糖酐酶和 碱性磷酸酶 。现有的环境小分子有机物免疫检测技 术大多数都是采用这一技术 ,70 多种农药和其它环 境小分子有机污染物的酶免疫检测有文献记载。 5. 3 荧光免疫检测 荧光免疫检测在物质分析中采用荧光信号。主 要的检测方式包括竞争结合荧光免疫检测 FIA 、免 疫荧光分析技术 FIMA 、 免疫荧光检测 IFMA 、 荧光 极性免疫检测 FPIA 和时间分辨荧光免疫检测 TRFIA 。荧光信号发生物主要有异硫氰酸酯 FITC 和罗丹明 RB200 等。荧光免疫检测技术和光导纤 维技术联合使用 , 开发了荧光免疫传感器。Eremin, S .A . 等研究了除草剂绿黄隆的快速特异性荧光偏振 免疫检测。Matveeva ,Evgenia G. 等研究了反相胶束系 统中抗原抗体的反应 ,采用阿特拉津的抗体萃灭荧光 标记阿特拉津的荧光 。这项工作提出了非极性介质 70 环 境 工 程 2005年 6 月第23 卷第3 期 中匀相荧光免疫检测的方法 萃灭荧光免疫检测 quenching fluoroimmunoassay ,QFIA 。 5. 4 化学发光免疫检测 化学发光物质 如 鲁米诺 , 标记的免疫检测技 术主要包括竞争结合化学发光免疫检测 CIA 、 免疫 化学发光检测 ICMA 、电化学发光免疫检测。应用 于环境污染物的检测的化学发光生物传感器也是一 个研究热点。Botchkareva ,Alexandra E. 等研究了 DDT 和相关 化合物 的固相 化学发 光流动 免疫检 测。 Samsonova,Jeanne V . 等研究了 HRP 标记的多种农药 的化学发光检测 。 6 免疫检测技术的新发展 6. 1 电化学免疫检测 电化学免疫检测是近年来发展起来的新的免疫 检测技术 。该方法主要是制备和应用产生电信号的 电化学活性物质 ,酶是常用的产生电信号的物质。它 的优点是快速、精确 。电化学免疫检测是小分子环境 污染物免疫传感器研究的主流技术 。Harris,R. D. 等 研究了除草剂西玛津 simazine 的组合光学表面等离 子体共振 Surface Plasmon Resonance , 缩写 SPR 免疫 探针检测。B. B . Dzantiev 等研究了基于分离自由双 酶免疫检测的测定绿磺隆安培计传感器 。 6. 2 脂质体免疫检测 这项技术中脂质体通常用来包埋大量的传统免 疫标记物 荧光或者酶的底物 ,抗原和抗体在脂质体 表面结合后,这些物质释放出来产生检测信号 。脂质 体免疫检测技术在小分子环境污染物分析领域的研 究已经出现 。Hianik ,T . ; nejd rkov 等研究了基于脂 膜、蛋白质膜和脂质体修饰的抗体免疫传感器。 Siebert,Sui Ti A . 等研究了甲草胺 alachlor 改进的脂 质体免疫迁移条带检测。 6. 3 免疫色谱技术 液相色谱和流动注射分析是新型免疫检测技术。 流动系统免疫检测的潜在优势为快速 、 精确 、 易于实 现自动化 、 可以和其他检测技术联合使用。这个技术 包括免疫亲合色谱技术 IAC 、高效免疫亲合色谱技 术 HPIAC 、流动注射分析 FIIA 、 流动免疫检测和提 取技术 。Bjarnason, Bjarni 等研究了水中除草剂阿特 拉津的流动注射酶免疫检测。Takatoshi Sakai 等采用 化学发光免疫传感器流动注射分析杀草强 Amitrole, 一种致癌的 EDCs物质 。 6. 4 免疫电泳技术 毛细管电泳 CE 是免疫检测技术应用的另一个 分离纯化方法。因为它具有快速分离 、 样品量小、使 用的试剂量少等潜在优势 ,从而引起许多研究者的关 注。和免疫色谱技术一样 ,免疫电泳技术也广泛应用 于当前的小分子环境污染物免疫传感器的研究。 Ensing ,Keesa 等研究了固定化抗体作为多用工具的组 合毛细管电泳技术。Little ,Monica K. 等应用固定化 抗体的毛细管电泳技术在线预浓缩了 10 -9级浓度的 阿特拉津。 7 小分子环境有机污染物免疫检测的应用现状 从20 世纪 80 年代开始 ,美国环境保护局 EPA 开始研究免疫检测在环境方面的应用 。1992 年 EPA 固体废弃物部门将免疫检测方法应用于检测五氯酚, 标志着免疫检测技术在美国环境检测中开始试用。 到1999 年,EPA 的固体废弃物部门共批准了 17 种物 质 包括五氯酚、多氯联苯 、 氯丹 、 DDT 、二英等 的 免疫检测。EPA 的水资源部也在考察定量免疫检测 技术在饮用水及废水检测中的应用。目前 EPA 标准 检测方法中 4 000免疫检测方法包括五氯酚、 2,4-D、 多氯联苯 、 石油烃类 、 多环芳烃、毒杀芬 、 氯丹、 DDT 、TNT 、三 嗪 类 化 合 物 RDX 的 免 疫 检 测。 Envirologixing lnc . 和 Strategic Diagnostics Inc. 公司可以 提供 EPA 批准的 17 种物质以及其它一些小分子环 境污染物的免疫检测试剂盒 。EPA 还将毛细管电泳 免疫检测技术 Capillary Electrophoresis Immunoassay 作为小分子环境污染物 2,4 -D 的推荐检测方法。 在我国 ,免疫检测技术逐渐引起研究人员和科研 机构的兴趣和重视。由南京农业大学主持,中国农科 院等单位参加的“十五”863 课题“农药残留免疫监测 技术研究及检测试剂盒研制” 。取得的主要成果为分 别改造或合成了甲胺磷、对硫磷等化学农药的半抗 原,与蛋白载体连接后获得了这些化学农药的人工合 成免疫原, 获得了特异性的多克隆抗体 、单克隆抗体 和重组抗体 ; 针对 5 种农药, 建立了可检测环境中农 药残留的酶联免疫吸附试剂 ELISA 方法 , 明确了 ELISA 方法的最低检测浓度、检测范围及其他质控参 数; 研制了 5 种农药残留现场快速检测的金标免疫试 纸条和室内快速准确检测的 ELISA 试剂盒,并成功用 于上百批次环境中农药残留的定性和定量检测; 并已 将ELISA 试剂盒和试纸条产业化。1996 年李俊锁和 钱传范制备了阿维菌素 abamectin 或者 avermectin 的 抗体, 以间接法 ELISA 对抗体进行了鉴定。1999 年 71 环 境 工 程 2005年 6 月第23 卷第3 期 刘曙照、冯大和和钱传范研究了甲奈威 西维因, carbaryl 的免疫检测技术。2001 年董健 、刘贤进和韩 昭军制备了氟虫腈 fipronil 的特异性抗体。 免疫检测技术成为环境有机污染物的可靠的 、 有 效的初步筛检手段。免疫检测技术的独特应用,包括 无挥发性的环境污染物及其非极性代谢产物 、 环境降 解产物的检测、危险物暴露评价和现场检测以及大量 样品的快速分析等 。小分子环境污染物的免疫检测 技术的进一步发展包括研究和开发标准化检测方法, 应用基因工程抗体、单克隆抗体技术提供性质稳定的 抗体,建立标准化的检测形式和数据处理模式。同 时,通过流动注射分析技术实现连续在线分析 ,通过 色谱技术和毛细管电泳技术等实现多种环境污染物 同时分析技术, 快速的免疫亲和技术用于快速分离制 备样品。用于现场快速灵敏的免疫检测技术也在不 断发展。免疫检测用于环境风险评价, 对于快速测定 污染物的安全暴露水平具有重要意义。 参考文献 1 Andrea Dankwardt . Immunochemical Assays in Pesticide Analysis. Encyclopedia of Analytical Chemistry . 1997. John Wiley and the thermal desoprtion rate decreased with desorption time. The measuring time could be shortened if the initial and final coulmn temperatures were changed from 50 to 70 ℃ and 250 to 230 ℃, respectively while the results remained unchanged. Keywords TVOC, gas chromatography, thermal adsorption and Tenax -TA tube STUDY OF ON -LINE SOFT MEASUREMENT OF RESPIRATORY RATE OF ACTIVATED SLUDGE BASED ON SBR Chen Jianbo et al 62 Abstract Respiratory rate is the main varibale in the process of activated sludge wastewater treatment. It directly reflects the activity of microorganism and degradation rate of organic matters during the process of aerobic biological treatment. Through studying the principles of measuring respriatory rate in activated sludge wastewater treatment, the soft measuring model of respriatory rate based on SBR is set up . In the end, the online value of microbial respiratory rate based on the experiment control plat is also obtained. Keywords respiratory rate, activated sludge, soft measuring, data fitting and simulink THE UATION OF SEWAGE TREATMENT BY AB FOR HEDONG SEWAGE TREATMENT FACTORY IN URUMQIHailiqimMaimaiti et al 65 Abstract The process of sewage treatment by AB in Hedong Sewage Treatment Factory in Urumqi and the characteristics of AB are recommended. The problems of operation are analyzed and a improving scheme for them is raised. Keywords sewage treatment, AB , aerobic and anaerobic EXPLORATION OF DETERMINATION OF PARTIAL HEAVY-METALS IN SOIL WITH DRY ASHING -ATOMIC ABSORPTION SPECTROPHOTOMETRYJia Haidong 67 Abstract The dry ash isused to treat the soil sampleswhenflame AAS is used to determine Cu, Zn, Pb etc in soil. The soil samples are heated up to 500 ℃ for digestion, and then extracted by acid. This has higher precision and accuracy, and is a fast one. Keywords soil, heavy metal, dry ashing digestion and atomic absorption spectrometry DEVELOPMENTOFIMMUNOASSAYFORSMALLMOLECULARENVIRONMENTAL POLLUTANTSYu Ruozhen et al 69 Abstract According to the present status of the immunoassay of small molecular environmental pollutants, it is introduced the principle, feature and the main steps of research and development of immunoassay. The assay ats, the design of hapten, synthesis of immunogen and preparation of antibody were presented. The new development and the application of the technology for environmental pollutants were reviewed. Keywords immunoassay , hapten and environmental pollutants THE EXPERIMENT STUDY ON EFFECT OF BUILDING STRUCTURE ON AIR POLLUTION Han Mingshan et al 73 Abstract This article has conducted the simulation research through the wind tunnel modeling test, studied the diffusion properties of air pollution under complicated environment, also discussed the effect of building structure s style change on the air pollution distribution, on the basis of that, analyzed the essential factorswhich influence the diffusion under the complicated environemnt, obtainedthe general rule of diffusion of air pollutants among complex construction structures. Keywords air pollution, atmosphere diffusion, building structure, wind tunnel and modeling test APPLICATION OF CONSTRUCTED RAPID INFILTRATION IN ACTUAL PROJECT Li Zhengyu et al 76 Abstract Combining project, this paper introduced the technology process and treatment effect of constructed rapid infiltration CRI system. The results indicated that except T -P CRI system had good treatment effect. When it treated domestic sewage, CODCrwas 5. 0 ～ 26. 0 mg L, SS was 1. 7～ 10. 0 mg L, NH3-N was 0. 30～ 2. 31 mg L. When it treated river sewage, CODCrwas8. 0～ 26. 0mg L, BOD5was 1. 0 ～ 6. 0 mg L, SS was 2. 0～ 6. 0 mg L, NH3-N was 0. 17～ 2. 54mg L. CRI system is worth popularizing as a new type of treating technology. Keywords constructed rapid infiltration, domestic sewage, river sewage and hydraulic loading 5 ENVIRONMENTAL ENGINEERING Vol. 23,No. 3, Jun. , 2005