阿霉素在羧基化纳米金刚石表面的负载与释放性能研究-sup-①-_sup-_朱华敏.pdf

阿霉素在羧基化纳米金刚石表面的负载与释放性能研究 ① 朱华敏1，2， 许向阳1，2， 邵诗宇1， 胡金宇1， 迟伶俐1， 刘艳茹1， 于美苓1 1.中南大学 资源加工与生物工程学院, 湖南 长沙 410083； 2.矿物材料及其应用湖南省重点实验室,湖南 长沙 410083 摘 要 利用高温氧化法实现纳米金刚石表面羧基化,以提高其对阿霉素药物的负载率。 通过考查高温氧化条件、药物浓度、溶液 pH 值等因素对其载药效果的影响规律,得出最佳载药条件,制备了负载量为 425 μg/ mg 的纳米金刚石-阿霉素体系。 探索了不同 pH 环境下该载药体系的药物释放规律,结果表明,羧基化纳米金刚石负载阿霉素后,可高效释药,最高释放率可达 91％,说明纳米 金刚石在改善药效发挥、降低药量、减少毒副作用等方面具有巨大潜力。 关键词 纳米金刚石； 高温氧化； 羧基化； 阿霉素； 药物负载； 药物释放 中图分类号 TB321文献标识码 Adoi10.3969/ j.issn.0253-6099.2019.04.031 文章编号 0253-6099201904-0131-05 Loading of Doxorubicin on Surface-Carboxylated Nanodiamond and Its Release Perance ZHU Hua-min1,2, XU Xiang-yang1,2, SHAO Shi-yu1, HU Jin-yu1, CHI Ling-li1, LIU Yan-ru1, YU Mei-ling1 1.School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, Hunan, China； 2.Key Laboratory of Mineral Materials and Application of Hunan Province, Central South University, Changsha 410083, Hunan, China Abstract High temperature oxidation approach was introduced to obtain a surface-carboxylated nanodiamond ND, so as to benefit the loading of doxorubicin DOX thereon. The influences of oxidation parameters, drug concentration and solution pH value on drug loading behavior were investigated. ND-DOX system with a loading capacity of 425 μg/ mg was prepared under the optimal conditions. Subsequently, the release perance of the loaded DOX under different pH conditions was studied. It is shown that carboxylated ND loaded with DOX can lead to a high-efficient drug release with the highest release rate attaining 91％, indicating that the ND carrier may have an application potential in improving drug efficacy, reducing drug dosage and minimizing drug toxicity. Key words nanodiamond； high-temperature oxidation； carboxylation； doxorubicin； drug loading； drug release 纳米颗粒作为载体材料应用前景广泛［1-4］。 爆轰 纳米金刚石粒径小、结构稳定、毒副作用小,可实现药 物缓释、减少药物用量及靶向治疗［5］,颗粒细化和稳 定分散是其在药物输送体系中的应用基础。 纳米金刚 石颗粒易团聚［6-8］,影响其与药物的反应速率及输运 能力,在生物医学上的应用受到限制。 抗肿瘤药物阿 霉素本身不具靶向性,对正常组织、器官有毒副作用, 长期使用会产生耐药性［9］,因而实现该药物的缓释具 有重要意义。 本文拟基于纳米金刚石表面基团调控, 提升其负载阿霉素的能力,并探索其缓释效果。 1 实 验 1.1 实验原料、试剂与仪器 主要原料包括纳米金刚石广州广达机电有限公 司,金刚石含量约 95％,杂质主要为石墨和无定形 碳,盐酸阿霉素北京华奉联博化学材料有限公司。 主要试剂有二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢 二钠和氯化钾,均为分析纯。 所用仪器设备主要有马弗炉KSY-4D-10,长实 电炉厂、傅里叶红外光谱仪尼高力 Nexus670,激发 波长为 532 nm,测试范围 4 000～400 cm -1 、Zeta 电位 分析 仪 及 纳 米 粒 度 分 析 仪 美 国 贝 克 曼 库 尔 特 Delsa440sx,功率 50 mW,激发波长 532 nm、激光粒度 仪英国马尔文 Mastersizer 2000,光源波长632.8 nm、 紫外可见分光光度计上海尤尼柯 UV 2600,测试范围 190～ 1100 nm、扫描电子显微镜日本电子 JSM - 7900F及能谱仪美国 EDAX 公司 PV5500/ EL-DV TEAM Pegasus等。 ①收稿日期 2019-01-25 基金项目 矿物材料及其应用湖南省重点实验室开放课题MMA201701 作者简介 朱华敏1995-,女,安徽铜陵人,硕士研究生,主要从事纳米粉体材料加工及其应用研究。 通讯作者 许向阳1971-,男,湖南平江人,博士,副研究员,主要从事超硬材料、矿物材料和复合材料研究。 第 39 卷第 4 期 2019 年 08 月 矿矿 冶冶 工工 程程 MINING AND METALLURGICAL ENGINEERING Vol.39 №4 August 2019 ChaoXing 1.2 羧基化纳米金刚石的制备 分别称取 0.2 g 纳米金刚石均匀平铺于 3 个瓷舟 底部,将瓷舟置于马弗炉内,在空气气氛中高温氧化。 设定升温速率为 5 ℃ / min,由室温升温至 425 ℃后分 别保温 1 h、2 h、3 h 后自然冷却至室温,将所得粉体于 研钵中机械研磨,获得羧基化样品。 所得样品按保温 时间长短依次记为 ND-T1h、ND-T2h 和 ND-T3h。 原料 样品记为 ND-T0h。 1.3 阿霉素在纳米金刚石上的负载 纳米金刚石负载阿霉素过程如下按浓度梯度要 求分别称取相应质量的阿霉素加至 50 mL 锥形瓶,再 倒入 40 mL 磷酸盐缓冲溶液pH7.4,水浴15 ℃以 下超声处理 30 min,得到橘红色阿霉素溶液。 再各 称取 5 mg 的纳米金刚石样品,加至上述溶液中,超声 分散 15 min 后,在室温下避光摇床振荡 24 h空气浴振 荡器转速设置为 160 r/ min,配得一系列负载体系。 1.4 阿霉素浓度计算 测定阿霉素溶液的紫外-可见光谱,确定最大吸光 度所对应的波长值,在此吸收波长下测定上述溶液的 吸光度,根据测量结果绘制吸光度-浓度标准曲线。 测 定在该波长下的紫外吸收值,计算得到阿霉素浓度。 1.5 载药率及阿霉素释放量测定 将含负载颗粒的溶液离心 30 min离心转速为 8 000 r/ min,测定上清液中游离阿霉素的浓度。 以起 始阿霉素含量减去游离阿霉素含量即得阿霉素负载 量,该负载量与纳米金刚石含量之比即为载药率。 将 干燥样品每份 2.5 mg溶于 5 mL 磷酸盐缓冲溶液 后,置于透析袋中,再将透析袋放入装有60 mL 缓冲溶 液的烧杯中。 将烧杯置于水浴锅中恒温37 ℃避光 搅拌后,取 3 mL 溶液测量紫外-可见光谱,依次定时取 样,测定析出液中的阿霉素含量。 阿霉素的释放量由 吸光度值确定,累积释放量由标准曲线计算得到。 2 结果与讨论 2.1 表面氧化对颗粒性能的影响 2.1.1 颗粒表面官能团变化 图 1 是纳米金刚石原料样品及高温氧化样品的红 外谱图。 由图可见,ND-T0h 在 3 433 cm -1 和 1 625 cm -1 处有强的羟基吸收峰。 热处理后,羟基峰峰强明 显降低。 1 110 cm -1 处附近的吸收峰应为 COC 基 团的伸缩振动,说明粉体表面存在该键合形式。 随着 热处理时间延长,相较于 1 267 cm -1 处的 CO 键的伸 缩振动吸收,该峰的相对强度略有下降,可归因于氧桥 键断裂,产生了更多的氧端基如 CO。 亲水基团 的增多,有利于改善颗粒在水体系中的分散性能。 3000400020001000 波数/cm-1 ND-T3h ND-T2h ND-T1h ND-T0h 1267 3433 2922 2850 1770 1720 1625 1110 图 1 氧化前后纳米金刚石样品红外光谱图 ND-T0h、ND-T1h 和 ND-T2h 谱图上 2 922 cm -1 和 2 850 cm -1 处的吸收峰分别为 CH 反对称和对称伸缩 振动,说明样品表面尚有一定量烃类基团,而 ND-T3h 谱图上,该振动峰基本消失。 ND-T0h 谱图上位于 1 720 cm -1 左右的吸收峰应为酮基的羰基CO的 伸缩振动峰,说明该原料表面的羰基并非源自羧基基 团。 氧化改性后,该峰消失。 氧化后的样品均在 1 770 cm -1 处出现了显著的 CO 吸收峰,该峰位可归为羧 酸基团的羰基伸缩振动吸收。 上述分析说明,热处理 过程中,纳米金刚石表面的甲基、亚甲基、酮基等官能 团逐渐被氧化成羧基基团。 ND-T3h 表面的羧基基团 相对强度较强,颗粒表面的亲水性和负电性增大,有利 于改善颗粒在水相中的分散。 2.1.2 表面荷电性能 图 2 是纳米金刚石表面氧化前后的 Zeta-pH 值曲 线。 纳米金刚石原料ND-T0h荷正电,与阿霉素表面 电性相同［10］,吸附阿霉素的能力较弱。 表面羧基化 后,颗粒呈负电性,且热处理时间越长,负电性越显著。 这可归因于氧化后,颗粒表面含大量羧基官能团,羧基 基团水解,表面负电性增大。 氧化处理后,颗粒荷负 电,且在 pH＞5 的介质体系中电位基本保持稳定。 pH 值为中性时,颗粒表面负电性强约为-26 mV,有利 于阿霉素在静电引力诱导下负载于颗粒表面。 pH值 ■ ■ ■ ■ ■ 30 20 10 0 -10 -20 -30 42681012 Zeta电位/ mV ● ●● ●● ● ● ▲▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲▲ ▲ ▲ ▲ ND-T0h ND-T1h ND-T2h ND-T3h ■ ● ▲ ▲ 图 2 表面氧化前后纳米金刚石颗粒的 Zeta-pH 值曲线 231矿 冶 工 程第 39 卷 ChaoXing 2.1.3 颗粒粒径分布 表面氧化前后金刚石团簇的粒度分布如图 3 所 示。 ND-T0h 的平均粒径高达 5.5 μm,团聚严重,不利 于药物负载与细胞吸收。 表面氧化后,ND-T3h 的平均 粒径降至 75 nm 左右,粒径大小均匀,基本分布在 50～ 150 nm 之间,说明纳米金刚石氧化效果均匀、亲水性 提高,分散性能显著改善。 粒度/nm 14 12 10 8 6 4 2 0 101100102103104105 体积分数/ ND-T0h ND-T3h ■ ● 图 3 羧基化改性前后纳米金刚石的粒径分布 2.2 颗粒负载阿霉素机理 2.2.1 负载颗粒形貌分析 图 4 为纳米金刚石羧基化前后样品、阿霉素、负载 阿霉素纳米金刚石的扫描电镜照片。 从形貌看,纳米 金刚石颗粒为 10 nm 左右较均匀的小颗粒组成的团 簇。 就单个颗粒而言,氧化后的样品比原料样品略小, 但同样存在团簇。 在水体系中,氧化样品的粒度显著 减少,这主要与颗粒表面亲水基团明显增多和表面荷 电情况改变有关。 在水相中阿霉素呈薄片状沉积在蓝 宝石衬底上,片层尺寸可达 1～2 μm。 引入纳米金刚 石颗粒后,阿霉素以其为载体,均匀负载。 负载后颗粒 大小为几十纳米至 200 nm 左右。 负载体系尺寸较阿 霉素胶束小,分散效果较好。 图 4 样品 SEM 照片 a Nd-T0h； b Nd-T3h； c 阿霉素； d 负载阿霉素的纳米金刚石 2.2.2 药物吸附负载机制 在 0～100 mg/ L 范围内按一定浓度梯度配制阿霉 素标准溶液,通过紫外-可见光谱,测定相应阿霉素浓 度下在波长为 485 nm 时的紫外吸收值,利用测量结果 绘制标准曲线见图 5a。 该标准曲线拟合度高 R20.999 55,可用于阿霉素吸附量计算。 由分光光 度计所测得的吸光度 y 与溶液中阿霉素浓度 x 之间的 关系分析药物负载情况。 y 0.016 37 20.933 19x1 阿霉素浓度/mg mL-1 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.000.020.040.060.080.10 吸光度 a 初始阿霉素浓度/mg L-1 500 400 300 200 100 20406080 载药率/μg mg-1 b ND-T0h/DOX ND-T3h/DOX ■ ■■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ● ● ● ● ● ●●● 图 5 阿霉素标准曲线a和阿霉素吸附量变化曲线b 图 5b是阿霉素在金刚石原料和羧基化样品上 吸附量的对比图中依序记为 ND-T0h/ DOX 和 ND- T3h/ DOX。 阿霉素在纳米金刚石原料上的吸附量约 为 22035 μm/ mg,随溶液中阿霉素浓度大小变化不 明显；当阿霉素浓度小于 50 mg/ L 时,其在羧基化样品 上的吸附量稳定上升,浓度大于 50 mg/ L 时,在羧基化 颗粒上的吸附量基本稳定,可认为已达饱和吸附量 425 μg/ mg。 由图可知,羧基化纳米金刚石对阿霉 素的吸附能力明显优于原料颗粒。 2.2.3 药物吸附微观机制 图6 是羧基化纳米金刚石ND-T3h、阿霉素DOX 和负载体系ND-T3h/ DOX的红外光谱图。 DOX 谱图 中,1 730 cm -1 处为羰基伸缩振动峰,1 615 和 1 583 cm -1 处为蒽环的两个羰基的伸缩振动。 在 ND-T3h/ DOX 的红外光谱中,1 615 cm -1 酰胺 I和1578 cm -1 酰胺 II 331第 4 期朱华敏等 阿霉素在羧基化纳米金刚石表面的负载与释放性能研究 ChaoXing 处的特征谱带可归因于CONH肽键基团的伸 缩振动,说明羧基化颗粒表面的羧基基团与阿霉素 的胺基之间可能存在静电或氢键作用。 DOX 谱线上 3 530 cm -1 处的宽峰是阿霉素分子中酚羟基的特征吸 收；3 330 cm -1 左右出现了胺基特征伸缩振动峰。 ND-T3h/ DOX 谱图上 1 770 cm -1 处的羧基伸缩振动峰 基本消失。 纳米金刚石在 500～800 cm -1 范围内无特 征峰,而负载阿霉素后,在 538 cm -1 处出现了较强的振 动吸收,这应该为阿霉素的特征峰。 结合上述分析可 知,吸附过程中二者参与反应的主要基团分别为羧基 和胺基,证实了阿霉素成功在纳米金刚石表面负载。 3000400020001000 波数/cm-1 ND-T3h/DOX ND-T3h DOX 3530 3330 1725 1770 1578 538 1578 1615 1725 1730 1583 15831615 1730 图 6 羧基化纳米金刚石、阿霉素和负载体系的红外光谱图 2.3 药物脱附效果探索 配制载药样品每份 2.5 mg,分别置于 pH 值为 2.5、5.0、6.4、7.4 的 5 mL 磷酸盐缓冲溶液中,分散均匀 后置于透析袋中,再置于相应 pH 值下的装有 60 mL 缓冲溶液的烧杯中,依次定时取样,测定析出液中阿霉 素的含量见图 7,以分析药物脱附行为。 释放时间/h 100 80 60 40 20 0 5010152025 释放率/ pH 2.5 pH 5.0 pH 6.4 pH 7.4 ■ ● ▲ ▲ 图 7 不同 pH 值下阿霉素的释放率与释放时间的关系 由图 7 可知,不同 pH 环境下阿霉素释放趋势具 有一致性9 h 之前为快速释放期,9 h 后释放变缓, 16 h 之后释放行为基本达到平衡,释放率 51％～91％。 相较而言,pH5.0 时,阿霉素释放量最大,可达 91％； pH7.4 时释放率最低,仅为 51％。 pH2.5 时,释放 9 h 就达到释放平衡,达到平衡时 间最短,但其最终释放量仅为 77％,释放量不如 pH5.0 时高。 人体肿瘤细胞液 pH 值范围约在 5.0 左右,故载 药颗粒在人体肿瘤细胞内应能很好地释放阿霉素,且持 续释放时间可达24 h,有利于药效发挥。 图 8 是药物脱 附后颗粒的形貌照片。 与释放前相比图 4d,颗 粒释药后表面无明显药物残余,颗粒大小为纳米级和 亚微米粒级,说明药物脱附后,颗粒未发生明显团聚。 图 8 药物释放后颗粒的 SEM 照片 表 1 为纳米金刚石载药后以及药物脱附后颗粒的 能谱分析结果。 表中数据说明,脱药前后,颗粒表面的 主要元素为 Al、O、C。 Al 和 O 应主要源自扫描电镜测 试时所用载物台蓝宝石,Al2O3,Pt 来自表面喷铂。 脱药后,载药体系中的 N、Cl、Na 含量不同程度降低, 甚至未检出。 Na 元素含量减低,应是缓冲溶液带来的 Na 在脱药后含量降低所致。 本文所用药剂盐酸阿霉 素中含 N 和 Cl缓冲溶液中也还有部分 Cl。 这两种 元素的降低,说明释药后颗粒表面阿霉素含量明显降 低,释放较完全。 表 1 载药和药物脱附后颗粒的能谱分析结果 元素 载药后释药后 质量分数/ ％原子分数/ ％质量分数/ ％原子分数/ ％ CK5.3110.2213.8323.73 NK0.731.20 OK27.2839.4030.3939.16 NaK2.612.620.910.82 AlK52.2444.7344.1333.72 PtM11.021.318.240.87 ClK0.810.530.780.45 3 结 论 1 羧基化纳米金刚石表面COOH 基团丰富,表 面电位可达-26 mV,平均粒径降为 75 nm 左右,在水 中分散良好。 2 羧基化纳米金刚石颗粒对阿霉素负载率高,吸 附量可达 425 μg/ mg,吸附效果优于纳米金刚石原料。 431矿 冶 工 程第 39 卷 ChaoXing 3 在 pH 5.0 时,所负载阿霉素的释放效果最 佳,释放量可达 91％,可赋予载药体系更好的靶向效 果,其释放时间可持续24 h,便于实现药物对肿瘤细胞 的精准治疗。 参考文献 ［1］ Gao W, Chen Y, Zhang Y, et al. 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