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声明声明下面论文由免费论文教育网 http//www.PaperE 用 户转载自互联网，版权归原作者所有，本文档仅供参考，严禁抄袭 免费免费论文论文教育教育网网 几种无机盐对矿物吸附几种无机盐对矿物吸附Bt毒蛋白的影响毒蛋白的影响1 付庆灵，王婉琴，胡红青，陈守文 华中农业大学农业部亚热带农业资源与环境重点实验室，武汉（430070） E-mailhqhu 摘摘 要要以高岭石 K、蒙脱石 M、针铁矿 G和二氧化硅 S为材料，研究了不同浓度 KNO3、KH2PO4和NH4H2PO4等 3 种无机盐溶液对矿物吸附Bt毒蛋白的影响，并探讨了无机 盐溶液与Bt毒蛋白不同加入顺序时，Bt毒蛋白在供试矿物表面的吸附特点。结果表明低浓 度无机盐促进矿物对Bt毒素蛋白的吸附，而高浓度时起抑制作用；无机盐和Bt毒蛋白加入顺 序实验表明，同时加入蛋白和无机盐时影响最为明显；3 种无机盐对供试不同矿物吸附蛋白 的影响程度大小为针铁矿 高岭石≥ 蒙脱石 二氧化硅；不同无机盐离子的影响程度 大小为H2PO4-NO3-，NH4K。 关键词关键词Bt；毒蛋白；矿物；吸附；无机盐；加入顺序 1. 前言前言 苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis, 简称 Bt，近缘于蜡状芽胞杆菌，革兰氏染色阳 性，是一种产生伴孢晶体，能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的芽胞杆菌，在其芽孢形成过程 中产生具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白。 自从 Schnepf 等 1981首次成功地克隆了第一个编码 Bt 杀虫晶体蛋白基因，大量 Bt 基因的克隆，为利用转基因技术进行植物品种改良提供了 丰富和有效的抗虫基因资源， 目前它在植物抗虫基因工程中应用最广泛。 随着转基因技术的 发展和 Bt 杀虫制剂的广泛使用， 大量 Bt 毒蛋白以多种方式进入土壤生态系统并在土壤中积 累 Saxena et al, 2002；Donegan et al, 1996，破坏土壤生物多样性，影响土壤的特异生物种 群、功能类群以及土壤生物多样性和土壤生态学过程，并最终威胁到整个土壤生态系统 李 云河等，2005，且很多影响可能存在时滞效应 王洪兴等，2002。 进入土壤的 Bt 毒蛋白可被粘土矿物 蒙脱石和高岭石、腐殖酸和有机矿物聚合体等土 壤表面活性颗粒快速吸附，并与之紧密结合，但不会与粉粒和砂粒结合 Tapp et al,1994； Crecchio et al, 1998, 2001；Venkateswerlu and Stotzky, 1992；Stotzky, 2000。75-85 的纯化 Btt 和 Btk 可被腐殖酸快速吸附， 吸附能力与其各种功能基的含量相关 Crecchio et al, 1998。 苏云金芽胞杆菌杀虫毒蛋白在矿物上的吸附非常迅速，1 小时即可达到最大吸附量的 70， 8 小时内就可产生最大吸附。毒素蛋白被土壤胶体吸附后仍具有杀虫活性，毒性甚至比非结 合态的还强 Tapp et al, 1994, 1995，经红外光谱和 X 射线衍射分析，吸附后毒素蛋白仅有 微小的结构变化 Stotzky, 2000，且具有良好的抗微生物降解性能，被吸附蛋白的杀虫活性 可持续存在 180 天或 234 天 Saxena et al, 2002；Tapp and Stotzky, 1998 。 土壤是一个复杂的生态系统，其中的无机盐离子如磷酸根、SO42-、NO3-、Cl-、HCO3-等 能影响土壤蛋白在矿物上的吸附 Gianfreda et al, 1992，继而影响土壤酶或蛋白的存在状态 及生物活性 Rao et al, 2000。赵振华等 2003研究表明磷酸根抑制土壤胶体表面对酸性磷 酸酶的吸附，但目前关于无机盐影响Bt 毒素蛋白吸附的研究报道较少。 本文以土壤中常见的高岭石， 蒙脱石， 针铁矿和二氧化硅 4 种矿物为材料， 研究了KNO3， KH2PO4和NH4H2PO4等 3 种含养分元素的无机盐溶液对矿物表面Bt 毒素蛋白吸附的影响， 以期阐明矿物表面蛋白吸附受无机盐离子影响的作用规律， 探讨土壤肥力因素与Bt毒素蛋白 1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20050504011）和教育部“新世纪优秀人才支持计 划”（NCET-05-0670）的资助。 -1- 积累的关系。 2. 材料与方法材料与方法 2.1 Bt 毒素蛋白的制备毒素蛋白的制备 将工程菌株WG-001 经BIOFLO-5000全自动发酵罐 美国NBS制备的发酵液喷雾干燥 得到原粉。取苏云金芽胞杆菌原粉约 4.0g，用去离子水洗 3 次。将洗后的沉淀配成水悬液， 充分分散，用 1 mol/L NaOH 调 pH 11-12，4-5 h 后再用 6 mol/L HCl 调 pH 7-8，16000 r/min 离心 15 min 去沉淀。上清液用 25 乙酸调 pH4.4，16000 r/min 离心 10 min，制得杀虫蛋 白无定形沉淀。用去离子水反复洗涤沉淀直至离心后上清液的电导率＜6 S/cm，冷冻干燥， 低温保存。经 SDS-PAGE 电泳扫描法检测，提取的 Bt 杀虫蛋白分子量约为 68 kDa。 2.2 矿物胶体制备矿物胶体制备 称取 100 g 购买的蒙脱石、高岭石、二氧化硅样品于 500 ml烧杯中，加去离子水至 300 ml 配成悬浮液，用 0.1 mol/L NaOH 调pH 8-10，超声波分散 30 min 经常搅动。将分散后 的矿物转入 2000 ml 烧杯中，按斯托克斯定律计算结果，静置一定时间后吸取上层悬液， CaCl2 絮凝，收集沉淀。用去离子水和 95乙醇洗涤沉淀至离心后的清液电导率＜6 S/cm， 烘干，研细，过 100 目筛即得分散于水中粒径＜0.2 m的胶粒。 针铁矿的制备 Atkinson et al, 1967取 50 g FeNO33. 9H2O 溶解于 825 ml 去离子水 中，在剧烈搅拌下，以 5 ml/min 的速度滴加 2.5 mol/L NaOH 溶液 200 ml，得到约pH 12 的 悬液。 将其在 60℃ 老化 48 h， 不时搅拌。 静置， 倾去上清液， 用去离子水洗 2 次， 5000 r/min 离心 15 min，收集沉淀，烘干研细备用。 2.3 吸附试验吸附试验 2.3.1 无机配体浓度变化对毒素吸附的影响无机配体浓度变化对毒素吸附的影响 将 Bt 杀虫晶体蛋白溶解于 pH 7.0 的 Tris-HCl 缓冲液中，充分溶解后 16000 r/min 离心 15min，去除不溶成分。无机盐浓度 0 – 200 mmol/L，pH7.0影响实验控制毒素浓度为 0.2 mg/ml，矿物胶体浓度为 0.5 mg/ml，体系总体积为 3 ml。毒素和矿物胶体的混合物在恒温摇 床于 251℃ 振摇 2 h 200 r/min，16000 r/ min 离心 15 min，280 nm 处测定上清液的吸光 度。同时设置对照。以牛血清蛋白制备标准曲线，计算蛋白在土壤胶体上的吸附量。 2.3.2 无机盐离子与毒素加入顺序对矿物表面蛋白吸附的影响无机盐离子与毒素加入顺序对矿物表面蛋白吸附的影响 设置 3 种加入顺序a先加无机盐后加毒素 L/T，即先加入矿物悬液和无机盐，震荡 1 h 后，再加入 Bt 毒素，继续震荡 1 h 后离心，280 nm 比色测定上清液毒素蛋白含量，计算 吸附量。b先加毒素后加无机盐 T/L，方法同 a；c同时加入毒素和无机配体 TL。 2.4 数据处理数据处理 实验均设 3 次重复，结果以平均值和标准差即 XSE 表示。 3 结果与分析结果与分析 3.1 无机盐浓度对矿物吸附无机盐浓度对矿物吸附 Bt 毒素蛋白的影响毒素蛋白的影响 由图 1 可见，无NH4H2PO4时，高岭石、蒙脱石、针铁矿和二氧化硅 4 种矿物的毒素吸 -2- 附量分别为 0.189，0.144，0.166 和 0.09 mg/mg。随NH4H2PO4的加入，4 种矿物毒素吸附量 都呈上升趋势，当NH4H2PO4浓度为 10 mmol/L时，供试矿物对Bt毒素蛋白的吸附量最大， 其中针铁矿吸附量增幅最大，达原吸附量的近 1 倍，说明在 0-10 mmol/L，NH4H2PO4的加入 均促进了 4 种矿物对Bt毒素的吸附。随NH4H2PO4浓度继续增加，高岭石、蒙脱石和二氧化 硅对于毒素的吸附量不再升高，而针铁矿的吸附量急剧下降，说明高出一定浓度范围后， NH4H2PO4的加入不但不能促进吸附，反而会抑制矿物表面的毒素吸附。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 050100150200 NH4H2PO4 浓度 Concentration of NH4H2PO4 mmol/L 毒素吸附量 Adsorbed the toxin mg/mg KMGS 图 1 NH4H2PO4对供试矿物吸附Bt蛋白影响 Fig.1 Effect of NH4H2PO4 concentration on adsorption of the toxin by the four minerals 图 2 表示加入无机盐KH2PO4时对矿物吸附Bt毒素的影响。与加入NH4H2PO4相似，供试 矿物对Bt毒素蛋白的吸附量在一定浓度范围 约 0-10mmol/L都有明显的提高，其中仍以针 铁矿最为明显， 吸附量由 0.166 mg/mg 迅速上升为 0.334 mg/mg； 高岭石次之， 吸附量由 0.189 mg/mg上升为 0.293 mg/mg，蒙脱石和二氧化硅表面吸附Bt量变化较小。高于 10 mmol/L的 KH2PO4溶液对矿物吸附毒素的影响表现为抑制作用，针铁矿毒素吸附量急剧下降至约 0.2 mg/mg，高岭石毒素吸附量下降至约 0.23 mg/mg。KH2PO4对供试矿物吸附毒素的影响程度 顺序为针铁矿高岭石蒙脱石二氧化硅。 -3- 0 0.1 0.2 0.3 0.4 050100150200 KH2PO4 浓度 Concentration of KH2PO4 （mmol/L） 毒素吸附量 Adsorbed the toxin mg/mg KMGS 图 2 KH2PO4 对供试矿物吸附 Bt 蛋白的影响 Fig.2 Effect of KH2PO4 on adsorption of the toxin by minerals 0 0.1 0.2 0.3 050100150200 KNO3 浓度 Concentration of KNO3 mmol/L 毒素吸附量 Adsorbed the toxin mg/mg KMGS 图 3 KNO3 对四种矿物吸附 Bt 蛋白影响的曲线 Fig.3 Effect of KNO3 on adsorption of the toxin by minerals 图 3 为KNO3对矿物吸附Bt毒素蛋白的影响。可以看出，KNO3浓度为 0-10 mmol/L，4 种矿物的毒素吸附量都随盐浓度升高呈上升趋势，表明低浓度KNO3促进供试矿物吸附毒素 蛋白，其中针铁矿的上升趋势最显著，吸附量提高了 0.073 mg/mg。随KNO3浓度继续增加， 供试矿物对蛋白的吸附量明显下降， 尤其是针铁矿和蒙脱石。 显然， 高于 10 mmol/L KNO3溶 液抑制供试矿物表面对Bt蛋白的吸附。 3.2 不同无机盐离子对供试矿物吸附不同无机盐离子对供试矿物吸附 Bt 毒素蛋白的影响毒素蛋白的影响 比较图 1 和图 2 可知，NH4H2PO4和KH2PO4加入后，针铁矿对Bt毒素蛋白的吸附曲线表 现出随无机盐浓度增高而先促进后抑制的趋势。 两曲线相比较可知， 曲线上升阶段两种无机 盐的促进作用基本一致，而在抑制阶段，NH4H2PO4的作用较KH2PO4大，吸附量前者由 0.33 mg/mg下降至 0.15 mg/mg， 后者则下降至约 0.2 mg/mg， 即加入NH4H2PO4的变化趋势更明显。 -4- 在无机盐浓度为 0-10 mmol/L时， 对蒙脱石和二氧化硅吸附蛋白的促进作用为NH4H2PO4明显 大于KH2PO4，而随无机盐浓度的继续增加，供试矿物对毒素蛋白的吸附量基本没有变化。 故对针铁矿、蒙脱石、二氧化硅表面蛋白吸附的影响程度为 NH4K。 比较分别加入KH2PO4和KNO3两种无机盐溶液时的矿物吸附毒素蛋白曲线 （图 2 和图 3） 可知，针铁矿起始蛋白吸附量都为 0.166 mg/mg，无机盐浓度增加到 10 mmol/L时，加入 KH2PO4的吸附毒素蛋白可达约 0.334 mg/mg，而加入KNO3者仅上升为约 0.239 mg/mg。而 在随无机盐浓度继续升高的抑制过程，针铁矿毒素吸附量的降低幅度仍以加入KH2PO4更明 显。 对于蒙脱石和高岭石具有同上的影响趋势， 但两种无机盐对二氧化硅吸附毒素的影响没 有明显差异。因此，H2PO4-和NO3-两种一价阴离子对矿物吸附Bt蛋白的影响为H2PO4-NO3-。 3.3 无机盐与无机盐与 Bt 蛋白加入方式对针铁矿吸附蛋白加入方式对针铁矿吸附 Bt 蛋白的影响蛋白的影响 由上述分析可知，无机盐对铁铁矿吸附Bt毒素蛋白的影响最大，故以下研究了无机盐加 入方式对针铁矿吸附毒素蛋白的影响。图 4 为NH4H2PO4 加入体系先后的影响，可以看 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 050100150200250 NH4H2PO4 浓度 Concentration of NH4H2PO4 mmol/L 毒素吸附量 Adsorbed the toxin mg/mg NPTT/NPNP/T 图 4 NH4H2PO4 加入方式对针铁矿吸附蛋白的影响 Fig.4 Effect of the entering mode of NH4H2PO4 on adsorption of the toxin by Goethite 注NP 代表 NH4H2PO4，T 代表毒素蛋白。NP means NH4H2PO4, T means toxin. 出，NH4H2PO4盐浓度为 0-10 mmol/L时，三种加入方式都促进矿物对毒素的吸附，先加入 NH4H2PO4和同时加入两种方式针铁矿对毒素吸附量较大，最大吸附量分别为 0.340 和 0.331 mg/mg，差异不显著，但是先加毒素蛋白的最大吸附量最小仅为 0.259 mg/mg。而在抑制阶 段 10 mmol/L，同时加入时针铁矿对毒素的吸附量下降最明显，其次为先加NH4H2PO4的 方式，但吸附量最终接近先加毒素的方式。 由图 5 可看出，KH2PO4在 3 种加入先后方式下针铁矿对Bt蛋白的吸附变化趋势一致， 均表现为随KH2PO4浓度升高先促进后抑制。在KH2PO4浓度10 mmol/L则在一定程度上起抑制作用，但最终矿物对蛋白的吸附趋向稳定。原因主要有1 无机盐离子的存在使矿物表面的电化学性质发生改变。 研究表明， 低浓度磷酸根在针铁矿表 面形成双基配合物，而在高浓度时，磷酸根则通过单基配合物吸附 Liu et al, 1995。磷酸根 在针铁矿表面的吸附导致针铁矿表面的电荷零点 PZC 下降，表面电位 φ0 降低，甚至 符号发生逆转介晓磊等，2000，而Bt毒素蛋白产生最大吸附与蛋白等电点和矿物的电荷零 点相关。2毒蛋白与无机盐离子复合物的形成。夏佑林等 1999 研究发现，当蛋白酶与磷 酸的摩尔比超过 11 时，磷酸-酶复合物就可出现，磷酸浓度的继续增大可使复合物大量存 在。由于立体位阻作用，复合物很难与粘粒矿物表面发生作用，因而高浓度磷酸抑制蛋白与 矿物表面的相互作用。3最终高浓度无机盐离子和毒蛋白对专性吸附点位的竞争已经达到 平衡，此时蛋白主要占据非羟基化表面，而无机盐离子主要占据羟基化表面，占据的位点不 同，对蛋白吸附的影响较小。 不同无机盐离子对矿物吸附毒蛋白的影响程度不同，表现为H2PO4-NO3-，NH4K， 主要原因是离子与矿物表面相互作用的能力不同。H2PO4-比NO3-更易在矿物表面配位吸附， 而NH4 比K 在矿物表面也具有更强的选择性， 因为NH4 可在硅氧片的六角形网孔中形成－ NH.C 键合，及在粘土矿物的层间氧平面附近通过－O.H－NH.C键形成键合 李学垣等， 1995。 无机盐对不同矿物间的差异主要是由于矿物类型不同引起的。蒙脱石是疏水的硅氧烷 型， 高岭石一半是硅氧烷型表面， 而针铁矿是极性亲水的水合氧化物型表面。 上述结果显示， 无机盐离子对针铁矿吸附毒素的影响最大， 主要是因为无机盐离子更容易与其表面发生相互 作用。 5 结论结论 研究结果表明，低浓度无机盐促进矿物对Bt毒素蛋白的吸附，而高浓度抑制吸附作用。 无机盐和Bt毒素蛋白加入顺序实验也证明了这一点， 且同时加入蛋白和无机盐时盐对蛋白吸 附的影响最为明显。 无机盐对不同矿物吸附蛋白的影响程度大小为 针铁矿 高岭石≥ 蒙 脱石 二氧化硅；不同无机盐离子的影响程度大小为H2PO4-NO3-，NH4K。 -7- 参考文献参考文献 介晓磊，刘凡，李学垣，周代华，徐凤琳. 磷酸盐吸附对针铁矿表面化学性质及锌次级吸附的影响. 河南 农业大学学报，2000，34 118-121. 李学垣，刘凡，赵玉萍，贺纪正，徐凤琳，黄巧云，黄昌勇，董元彦. 土壤化学及实验指导. 中国农业出版 社，1995. P 137. 李云河， 王桂荣， 吴孔明， 张永军， 原国辉， 郭予元. Bt 作物杀虫蛋白在农田土壤中残留动态的研究进展. 应 用与环境生物学报，2005，11 504～508. 王洪兴， 陈欣， 唐建军. 释放后的转抗病虫基因作物对土壤生物群落的影响. 生物多样性， 2002， 10 232-237. 赵振华， 黄巧云， 李学垣， 郭学军. 磷酸盐对土壤胶体和矿物表面吸附酸性磷酸酶的影响. 土壤学报， 2003， 40 353-359. Atkinson, R.J., Posner, A.M., Quirk, J.P., 1967. Adsorption of potential determining ions at the ferric oxide aqueous electrolyte interface. Journal Physical Chemistry, 71550-558 Crecchio, C., Stotzky, G., 1998. Insecticidal activity and biodegradation of the toxin from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki bound to humic acids from soil. Soil Biology Insecticidal protein; Minerals; Adsorption; Inorganic salts -9-