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酒 泉 职 业 技 术 学 院 毕毕 业设计（论业设计（论 文）文） 09 级 石油化工生产技术 专业 题 目紫外分光光度法测定水果中维生素 C 的含量 毕业时间 2012 年 6 月 学生姓名 张继鹏 指导教师 任小娜 班 级 石化一班 2011 年 3 月 20 日 酒泉职业技术学院 2012 届各专业 毕业论文（设计）成绩评定表 姓名张继鹏班级09 级石化一班专业石油化工生产技术 指导教 师第一 次指导 意见 1.题目要居中放置，摘要的内容不完善，要重新写。 2.维生素 c 的理化性质应该用一段文字来叙述对仪器的一些参数要用一段文字 叙述。 3. 将论文的格式修改为规定格式。 2011 年 5 月 18 日 指导教 师第二 次指导 意见 1.对紫外设备的介绍中首先应说一下紫外分光光度法测定维生素 c 的优点。 要说明紫外分光光度法定量基础。 2.在介绍完原理以后应加仪器的概述，加入图表时应加表头。 3.将实验原理中的一些内容融合到实验部分，多余的删除。 2011 年 5 月 27 日 指导教 师第三 次指导 意见 1.对论文中的错别字进行修正，论文中的标点符号要规范。 2.注意论文中化学离子的上标和下标，同时化学式的第一个字母应该大写。 3.论文中对仪器介绍的部分应该调整到分类的后面， 4.实验部分应该写全称，同时进行再完善。 2011 年 6 月 1 日 指导教 师评语 及评分 成绩 签字（盖章） 年 月 日 答辩小 组评价 意见及 评分 成绩 签字（盖章） 年 月 日 教学系 毕业实 践环节 指导小 组意见 签字（盖章） 年 月 日 学院毕 业实践 环节指 导委员 会审核 意见 签字（盖章） 年 月 日 说明1、以上各栏必须按要求逐项填写.。2、此表附于毕业论文 设计封面之后。 前言................................................................6 第一章 维生素 C 的性质及测定方法...................................6 一、维生素 C 概述..................................................6 二、理化性质 .....................................................6 三、维生素 C 的作用 ...............................................7 四、测定方法概述..................................................7 （一）原子吸收分光光度法 ........................................7 （二）紫外可见分光光度法 ........................................8 （三）高效液相色谱法 ............................................9 第二章 紫外分光光度计相关方面的介绍................................9 一、紫外分光光度法测定的优点......................................9 二、紫外分光光度法测定原理基础...................................10 （一） 比色分析的原理 ..........................................10 （二）紫外可见分光光度法定量基础 ...............................10 三、 仪器概述....................................................11 一仪器介绍 ...................................................11 四、 可见紫外分光光度计的应用 ..................................13 （一）光谱分析 .................................................13 （二）溶剂对紫外光谱的影响 .....................................13 （三）吸光系数 .................................................14 第三章 实验部分....................................................14 一、 仪器与试剂.................................................14 二、 实验方法...................................................14 （一）校准曲线的绘制 ...........................................14 （二）样品的测定 ...............................................14 （三）结果计算 .................................................15 三、 结果与讨论.................................................15 （一） 反应条件选择 ...........................................15 （二）方法的相关性和检测范围 ...................................16 （三）方法检出限 ...............................................17 （四）方法准确度 ...............................................17 （五）方法精密度 ...............................................18 （六）不同方法对比试验 .........................................18 （七）干扰物质的消除 ...........................................19 （八） 酸度的影响 .............................................19 四、分析过程中的注意点...........................................19 第四章 总结........................................................20 一、实验启示.....................................................20 二、建议.........................................................20 致 谢.............................................................21 参考文献...........................................................22 摘 要目前研究维生素研究维生 C 的测定方法的报道较多，如滴定法、光 度分度法、高效液相色谱法等，特别是紫外分光度测定法。本论文利用维生素 C 具有对紫外产生吸收和对碱不稳定的特性, 建立了紫外分光光度快速测定水 果维生素 C 含量的新方法。维生素 C 浓度在 1.0012.0g/mL 范围内与吸收值 呈良好的线性关系；检出限为 0.014g/ mL；加标回收率在 97.9 99.0 之 间。该法操作简单,结果准确,应用于维生素 C 含量的测定, 结果令人满意。 关键词维生素 C，紫外分光度测定法，水果 前言前言 维生素 C 是可溶于水的无色结晶，是一种分子结构最简单的维生素。维生 素 C 有防治坏血病的功能，所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。维生素 C 能保 能保持巯基酶的活性和谷胱甘肽的还原状态，还有解毒作用等。其广泛存在于 植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、 柑橘等食品中含量尤为丰富，对饮食健康、医疗保健都具有十分重要意义。近 年来测定维生素 C 的方法主要有滴定法、光度法、高效液相色谱法等。 1 维生素 C 的性质及测定方法 1.1 维生素 C 概述 维生素 C 又叫抗坏血酸（Ascorbicid），广泛存在于植物组织中，新鲜的 水果、蔬菜中含量较多，是一种水可溶性小分子生物活性物质，也是人体需要 量最大的一种维生素。维生素 C 具有还原性（其结构式如图 1），可以与许多 氧化剂发生氧化还原反应，因此可以利用其还原性测定维生素 C 的含量。目前 食品中测定维生素 C 含量的方法主要有碘量法，是利用维生素 C 的氧化还原性 为基础的一种氧化还原方法。因其酸度不易把握，碘需要标定且易挥发，而维 生素 C 不易稳定保存，使测定结果易出现偏差，且这种方法不适合微量分析； 国标 GB/T6195-1986 是采用 2,6二氯靛酚滴定法。利用样品溶液由蓝色转变 为粉红色来辨别其滴定终点的到使测定准确度降低。另外还有荧光光谱分析法 J、色谱电化学法等，这些方法都存在着一定的局限性，如操作过程复杂，所用 试剂不稳定，速度慢、背景干扰大。近年来，建立的测定维生素 C 的其他方法 还有催化动力学和光度法相结合的方法，及维生素 C 传感器测定方法，固定 pH 滴定法等。本论文将用紫外可见分光度法对水果中的维生素 C 含量的检测方 法进行综述、比较。 图 1 维生素 C 的结构式 1.2 理化性质 维生素是维持机体生长和代谢所必需的一类低分子化合物的统称。在皮肤 护理和衰老中起着重大的作用。其中维生素 C 是日常生活中最为熟知的，同时 也是人体内不可缺少的维生素之一。维生索 C 是一种含有 6 个碳原子的酸性多 羟基化合物，其 C2 和 C3 位上两个相邻的烯醇式羟基极易解离而释放出 H，所 以维生素虽然不含自由羧基，仍然具有有机酸的性质。维生素 C 呈无色无臭的 片状晶体，易溶于水，不溶于脂溶剂。在酸性条件下稳定，遇到空气中的氧、 热、光、碱性物质，特别是有氧化酶及痕量铜、铁的金属离子存在时，可促进 其氧化破坏。加热或在溶液中易氧化分解 ，呈现强还原性，为己糖衍生物 。 紫外吸收最大值 为 245nm。 1.31.3 维生素 C 的作用 维生素 C 的作用之一维生素 C 最重要的作用就是参与促进机体蛋白质合 成的生化反应，如结缔组织中的胶原蛋白、组织细胞间质和神经递质的合成等 过程。胶原蛋白对于人体的组织细胞、牙龈、血管、骨骼、牙齿的发育和修复 都是一种重要的物质。维生素 C 缺乏，胶原合成减少，血管壁和骨骼的脆性会 增加，使血管易于出血，骨骼易骨折。维生素 C 可维持皮肤的弹性，保护大脑， 有利于组织创伤更快愈合，还可以促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血。 维生素 C 的作用之二维生素 C 能参与氨基酸代谢，促进氨基酸中酪氨酸 和色氨酸的代谢，延长机体寿命。并且可以改善脂肪和类脂（特别是胆固醇） 的代谢，预防心血管疾病，改善机体对铁、钙和叶酸的利用，帮助铁的吸收， 并有助于治疗缺铁性贫血。 维生素的作用之三维生素 C 是一种抗氧化剂，在生物氧化及还原过程和 细胞呼吸中起重要作用。它在人体内是酶的激活剂和物质的还原剂，是多种自 由基的清除剂。同时还可与维生素 E 协同作用，发挥更强的抗氧化功能，从而 有效地防治心脑血管疾病、癌症等严重影响人类生存质量的疾病。 维生素 C 的作用之四维生素 C 还可以降低毛细血管的通透性、刺激凝血 功能、增加人体对外界环境和疾病的抵抗力和免疫力，并有参与解毒功能，保 护肝脏，具有抗组胺及阻止致癌物质生成的作用。 1.4 维生素 C 测定方法概述 1.4.1 原子吸收分光光度法 利用原子吸收分光光度法间接测定维生素 C 的含量，是利用维生素 C 可以 与一些金属离子发生氧化还原反应，通过测定反应掉的金属离子的量，进而间 接计算出维生素 c 的含量。 1.4.1.1 以银离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法 以银离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法，是利用维生素 C 分子中 的有二烯醇基具强还原性，可被硝酸银氧化为去氢维生素 C，同时产生黑色银 沉淀（反应式如图 2）。沉淀经离心分离后，将分离得到的沉淀用硝酸溶解后， 再利用原子吸收分光光度计测定银离子的含量，从而接测得维生素 C 含量，具 体测定方法如下配制一系列浓度的维生素 C 标准溶液，依次吸取一定量的维 生素 C 标准溶液置于 10mL 离心管中，分别加入 2mL（1mg/mL）Ag标准溶液，然 后加水使总体积为 4mL，摇匀，在室温下避光放置 35min 离心分离弃去上清液， 用 2mL 超纯水洗涤沉淀 3 次，然后用 l1 的浓硝酸 3mL 溶解沉淀，移入 50mL 的 容量瓶中，加水稀释至刻度。喷入空气乙炔火焰分别测定其吸光度，以维生 素 C 标准溶液的浓度为横坐标，以测得的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。最 后将处理过的待测样按上述方法测定其维生素 C 含量。 图 2 维生素 C 与银离子反应的反应式 上述方法因维生素 C 标准溶液及样品的配制都是利用 2％的柠檬酸作为溶 剂，并在棕色瓶中保存，原因是维生素 C 在溶液中不稳定，遇氧气、光、热、 碱性物质易受破坏，而在适当的酸性条件下比较稳定，用 2％的柠檬酸溶液来 配制维生素 C 标准溶液，减缓了维生素 C 被氧化的速度，同时消除了一定外界 因素的十扰，使得测定结果比较稳定。 1.4.1.2 以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法 以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法也是利用维生素 C 在酸性 介质中维生素 C 可将 Cu2定量的还原为 Cu，然后 Cu与 SCN-反应生成 CuSCN 沉 淀，在高速离心机下有效地分离出 CuSCN 沉淀，洗涤后再经浓硝酸溶解，用原 子吸收法测定沉淀中的含铜量，即可推知样品中维生素 C 的含量。具体测定方 法如下分别吸取 1mL 配制的含一定量维生素 C 的标准溶液随配随用分别含 维生素 C 50g、100g、200g、300g、400g、500 g和样品提取液，依次 放置于已编号的 15mL 离心管中，各加入 1mLCuSO4饱和溶液、1mL 浓度为 2％硫 氰酸铵溶液、0.5mL 盐酸醋酸钠缓冲液和 0.5 mL 饱和 NaCl 溶液充分混和， 稍后离心分离,弃去上层清液，小心地用少量水洗涤沉淀 2～3 次注意每次用水 不能超过 1 mL，加入 0.5mL 硝酸溶解后，转移至 lO0mL 的容量瓶中加水定容 至刻度线，摇匀。分别用原子吸收分光光度计测定其含铜量，由所得的维生素 C 含量的标准曲线，可以得到相应样品的试验结果。 该方法所得的试验结果相对标准偏差 RSD 在 5％以内加标回收率在 96.56％～100.67％，其精密度和准确度均达到痕量分析要求。此方法的线性相 关系数 R0.9989，表明相关性很好。 1.4.2 紫外可见分光光度法 1852 年，比尔（Beer）参考了布给尔 （Bouguer）1729 年和朗伯 （Lambert）在 1760 年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液 层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光 度法的理论基础，这就是著名的比尔朗伯定律。1854 年，杜包斯克 （Duboscq）和奈斯勒 （Nessler）等人将此理论应用于定量分析化学领 域，并且设计了第一台比色计。到1918 年，美国国家标准局 制成了第 一台紫外可见分光光度计 。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又 出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光 度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。紫外可见分 光光度法从问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学 科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全， 使得光度法的应用 有了较大的 范围。 1.4.3 高效液相色谱法 前面介绍的方法由于在使用中有一定的限制，操作复杂、前处理较麻烦。因此 在使用中有较大的局限性，目的已逐渐被高效液相色谱法所取代。HPLC 法具有 检测速度快、操作简单、实验结果可靠等特点。 王艳颖，姜国斌等采用 HYPERSIL-C8fz 谱柱、浓度 0.1％的草酸作流动相的高 效液相色谱法，分析了草莓中的维生素 c 含量，取得了理想的效果。HPLC 检测 条件如下流动相 0.1％草酸溶液，流速 1.0 mL/min；检测波长 254 nm，进样 量 5L，柱箱温度 3O℃。该方法分析中受样品中其他杂质的影响较小。测定草 莓中维生素 C 的含量，回收率为 97.4％～102.1％，说明该方法具有所需试剂 少、稳定、操作简便等特点。精密度实验的相对标准偏差小于 3％，说明该方 法重复性和再现性都是比较高的。 陈昌云等采用 0.05 mol／L 磷酸二氢钾缓冲液甲醇8020v／v作流动 相。流速为 1.0 mL／min，二极管阵列检测器，检测波长为 254 nm。测定蜜柚 中维生素 C 含量在质量浓度为 20～100mg／L 范围内有良好的线性关系，方法回 收率为 92.4％～107.5％,相对标准偏差小于 2％。 综上所述，测定维生素 C 含量方法很多，各种方法各有优缺点，因为维生 素 C 自身的不稳定，导致了很多方法测定结果误差较大，所以对维生素 C 稳定 存在条件的探索非常重要。紫外可见分光光度法因为测定较准确、灵敏度高、 选择性好，有较好的发展前景，是目前发展较快的一种方法。。 2 紫外分光光度计相关方面的介绍 2.1 紫外分光光度法测定的概述 利用紫外分光光度法测定维生素 C 的含量是基于维生素 c 在紫外光区有特 征吸收，但是因为维生素 C 结构中具有不饱和键，具有还原性，不易稳定存在， 直接测定误差较大。所以在利用紫外分光光度法测定时，维生素标准溶液和待 测样的配制条件非常重要。曾国富，黄玉英研究发现，维生索 C 在 CTAB- C5H11OH-H2O 微乳液体系中非常稳定，它存在于微乳液滴膜的内侧，与渗透进入 液滴膜外侧的溶液氧接触的机会极少，该体系能极大地提高维生素 C 的稳定性。 郑京平等利用维生素 C 具有对紫外产生吸收和对碱稳定的特性，建立了紫外分 光光度快速测定水果、蔬菜维生素 c 的新方法。根据维生素 C 具有对紫外产生 吸收和对碱不稳定的特性，于波长 245nm 处测定样品溶液与碱处理样品两者吸 光度之差，通过查校准曲线，即可计算样品中维生素 C 的含量。此法操作简单、 快速准确、重现性好，结果令人满意。特别适合含深色样品的测定。实验结果 表明该方法简单易行，结果准确、灵敏度高，检出限低，可快速测定水果中维 生素 C，值得推广应用。张立科等介绍了在 0～450g／mL 线性范围内，以 Cu2 作催化剂，以溶解氧将还原型维生素 C 氧化为在 245.0 nm 处无吸收的氧化型维 生素 C，实现了样品各紫外干扰成分的本底校正，建立了种测定水果中维生素 C 破坏条件的选择尤为重要，确定条件为Cu 用量为 30 g，反应温度为 70℃， 反应时间为 20min，加热条件下，反应速度快，无需加掩蔽剂。方法简便、快 速、准确，测定了香蕉、西红柿等果蔬中的 VC 含量，结果令人满意。经多次实 验得出该方法 RSD 在 0.32％～0.89％之间，实际测定了香蕉、西红柿等样品中 的维生素 C 的含量，检出限为 0.2791g／mL，加标回收率在 97.16％～100.18 之间 。 2.2 紫外分光光度法测定原理基础 2.2.1 比色分析的原理 光是一种电磁波，它的波长用 nm 为单位，人的眼睛所能感觉到的光波长约 400～760 nm，这之间的光波称为可见光。短于 400 nm 的叫紫外线，短于 200nm 的叫远紫外线，再短的就是 X 射线和 γ 射线了。长于 760nm 的叫红外线， 红外线可长达 5mm，再长的就是无线电波了。 普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种日光或白炽光通过棱镜可以分 解为红、橙、黄、绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。如果在白炽 灯光与棱镜之间放一个有色溶液的玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处 或几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶液的吸收光谱，吸收光谱显示 该溶液对光的选择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸收光谱中透过最 多、吸收最少的那部分波长光线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收最 多的那部分波长光线的颜色。 不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和吸收光谱不同。因此可以根据 其光谱的特征和强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光谱分析法，这也 是比色分析的原理。根据发射光谱分析的如火焰发射光谱法又称火焰光度法， 分析钠、钾、钙，荧光光度和荧光分光光度法根据荧光的发射强度进行分析。 根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法，如应用可见光的吸收光谱进行 分析的普通的分光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱进行分析的叫紫 外分光光度计和紫外分光光度法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子吸 收分光光度计和原子吸收分光光度法。 2.2.2 紫外可见分光光度法定量基础 当一束单色入射光[ I0]通过厚度为 L、浓度为 C 的有色溶液后，所透过光 的强度[ I1 ]与溶液厚度 L 及浓度 C 成负指数乘积的关系I1I010－KLC 如 果物质在溶液中的浓度和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律通过比色 方法从显色强度求浓度，这是比色分析的原理。I1I010－KLC移项成 I1/I010－KLC 式中 K 为常数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长不同 而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。上式写成以 10 为底的对数， logI1/I0－KLC，再以透光度 TI1/I0时，则上式成为 logT－KLC 或者－logTKLC。I1/I0称为透光度或透光率，表示透过光强度是入射光强 度的百分之几，其数值只能＜1，从 0～100。为了方便起见，经常用透光度的 负对数－logT 来表示溶液吸收光线的情况，并称为吸光度ABS、消光度E、 或光密度OD 或 D，这样，ABS KLC。 该式说明溶液的吸光度和浓度 C、厚度 L 之间皆成正比关系。当厚度一定 时，溶液的浓度增加，则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依据。实际 使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相对固定的，有 0.5、1、2、4cm 的比色杯，使用最多的是 1cm 的比色杯。 比色分析中有时也用透光度做单位，根据透光度的负对数－logT吸光度， 透光率为 100时，吸光度－Iog10，而透光率为 1时，吸光度 －log0.012，二者间呈对数指数关系。 当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线正比关系时才能进行比色分析， 如果溶液的吸光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律），则不能使用比色 分析。有时，溶液的浓度只在一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超过 一定限度时，失去正比关系，则不能一概地用比色结果换算，通常都要研究测 定方法中什么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制一系列浓度和吸光度 之间的标准曲线，发现浓度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折，说明 超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用来比色分析。可见光、紫外、荧光分 析都要求溶液必须透明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。对特殊的 均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌 计数的比浊测定。 光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在玻璃、溶液的表面被反射或散 射，影响到吸光度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射光、散射光、试 剂中杂质、非反应物的影响，即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃对 紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上使用普通玻璃比色杯，而在紫外分 光光度计上必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。 2.3 仪器概述 2.3.1.棱镜式分光光度计 棱镜式分光光度计采用棱镜作为分光元件，是分光光度计诞生前后分光的 主要元件，随着电气化的发展，棱镜分光给结构设计带来了很大的麻烦，应用 起来不够灵活，所以逐渐的被淘汰了，但在相当长的一段时间内，国内外的主 要厂商都采用棱镜，到目前为止还有部分国内厂商在 721、751 等分光光度计上 采用棱镜作为分光元器件。我们后边讨论的都是光栅式分光光度计，棱镜式后 面不作分析。2.3.2 单光束分光光度计 1945 年美国 Beckman 公司推出的世界第一台成熟的分光光度计，就是单 光束分光光度计。单光束分光光度计只有一束单色光、一只比色皿、一只光电 转换器。这种分光光度计测试过程简便，有高、中、低档之分。低档的目前国 内有两种一种是手动设置波长，通过旋钮转动刻度盘，同时带动光栅，从而 达到设置波长的目的；一种是自动设置波长，通过电机带动扇形齿轮，同时带 动光栅，从而达到自动设置波长的目的。这两种单光束分光光度计，之所以说 它们低档，主要是因为它们的技术指标相对较差，他们的主要技术指标像波 长准确度一般在2nm，波长重复性一般在 1nm，功能也相对简单，测试结果 误差较大。例如目前国内用的较多的型号有721（上分）、722（上分）、 751（上分）、752（上分）、754（上分）、T6（北京普析）。中档的目前 国内一般采用丝杆结构，采用自动波长设置，电路设计也比较合理，采用较好 的屏蔽技术和滤波技术，成品仪器比较稳定，也不易受外界的干扰，但是这种 仪器，每个厂家做出来的效果不尽相同，有的做出来很不稳定，有的却很可靠， 因为每个厂家的技术存在很大的差异，特别是在关键点上的处理，例如 190nm 处的稳定性，国内目前很少有厂家做的好，有的厂家甚至在 200nm 处还很不稳定，220nm 处的杂散光，国内厂家目前一般在 0.2[]T，很少有 厂家能做到 0.1[]T 以下，这种档次的仪器的波长准确度一般能做到 0.5nm，波长重复性一般能做到小于 0.3nm。这种档次的仪器目前的性价比 比较好，销量也很不错。像国内现在比较流行的型号如756。高档的单光束 分光光度计，一般采用非常先进的微机处理技术，电路设计也是非常的出色， 结构设计也是极为合理，光路准确可靠，此类单光束分光光度计基本可以和准 双光束以及双光束媲美，主机功能丰富，界面清晰，读数直观。 图 3 单光束紫外可见分光光度计的基本结构 2.3.3 仪器介绍 现以 DV 650 单光束扫描型紫外分光光度计美国贝克曼公司为例， DV650/850/950 紫外/可见/近红外分光光度计是 PERKINELMER 公司在集多年先 进经验制造的，代表了目前世界此类仪器最高水平的双光束、双单色器系统比 率式紫外/可见/近红外分光光度计。 波长范围DV650 为 190～900nm,整机及 光学系统采用宇航技术的硬件整个光学系统均采用涂覆 SiO2 的全息刻线光栅 紫外/可见刻线数为 1440 条/mm，近红外 360 条/mm；采用最先进的四区分段 的扇形信号收集的斩波器，确保了每次得到最准确样品和参比的信号（斩波器 运转期间，样品和参比的信号分别单独被各自的黑区信号所校正，波长精度最 高紫外/可见区 0.08nm）； 采用预校准并可自动切换的碘钨灯与氕灯；在整 个紫外/可见区采用高灵敏度光电倍增管；宽大的样品仓可放入各种附件并将 光路调整至最佳，可选附件最多如积分球、固定/可变角的相对/绝对镜反射附 件等），稳定性好、基线平直度度、杂散光低。仪器极其稳定、经久耐用。线 性范围宽8A；多种软件可选UV Winlab 操作软件包（标准配置，包括酶动力 学 KinLab 及生化方法 BioLab）、ASSP 高级软件包包括色度、滤光片、建筑玻 璃、防护玻璃、数学运算及数据库等的模块功能。分光光度计从分光元件来讲 可分为棱镜式和光栅式两种，也有光栅加棱镜的高档分光光度计，现今的分光 光度计大部分采用光栅分光。从结构上来区分可分为单光束、准双光束、双光 束和双波长分光光度计。 2.4 紫外可见分光光度计的应用 2.4.1 光谱分析 有时候需要研究某物质在某溶剂中的光谱特性，如维生素 c 的乙酸溶液在 252.0 nm 和 237.5nm 处有吸收波峰。大多数情况下，比色分析都提供了使用光 的波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提供使用波长的话，可以用紫外 分光光度计从 200～1000nm 范围内扫描吸收光谱，搜索到吸收峰，再用吸收峰 波长来比色分析。 2.4.2 溶剂对紫外光谱的影响 在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择 非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收 光谱的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所 选择的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰 物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂 的吸收不可忽略。 2.4.3 吸光系数 朗伯-比尔定律中的 K 称为吸光系数。因比色杯的直径用 cm 为单位，因此 K 的单位决定于浓度 c 用什么单位，如 c 以 mol/L 为单位时 K 称为摩尔吸光系 数，用 Emol或 εmol表示；如果物质的分子量未知，浓度可用为单位，K 称为百 分吸光系数，用 E表示。 3 紫外分光光度法测定水果中维生素 C 的含量 3.1 仪器与试剂 仪器DV 650 单光束扫描型紫外分光光度计美国贝克曼公司;AE-2240 电子天平瑞士梅特勒公司; 高速组织捣碎机; 800 型离心沉淀器上海手术器 械厂。 浸提剂 2. 0 W /V 偏磷酸溶液 0. 5mol/L 氢氧化钠溶液; 100g/mL 抗坏血酸标准溶液。 以上试剂均为分析纯, 实验用水为蒸馏水。 3.2 实验方法 3.2.1 校准曲线的绘制 称取抗坏血酸 10mg（准确至 0. 1mg）, 用 2 偏磷酸溶解，小心转移到 100mL 容量瓶中, 并加偏磷酸稀释到刻度, 混匀, 此抗坏血酸溶液的浓度为 100g/ mL。吸取 0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL 抗坏 血酸标准使用溶液, 置于 10mL 比色管中; 用 2 偏磷酸定容, 摇匀。 此标准 系列抗坏血酸的浓度分别为 0.00、 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10. 0、12. 0g∕ mL。以蒸馏水为参比在波长 243nm 处, 用 1cm 石英皿测定标准 系列抗坏血酸溶液的吸光度。抗坏血酸吸光度为 A , 试剂空白吸光度为 A 0, 计算吸光度差△A A – A0的值。以吸光度差值△A 对抗坏血酸浓度 C 绘制 校准曲线。 3.2.2 样品的测定 样液的制备将水果、蔬菜样品洗净、擦干,称取具有代表性样品的可食部 分 100g,放入组织捣碎机中,加入 100mL 浸提剂,迅速捣成匀浆。称取 1050g 浆状样品,用浸提剂将样品移入 100mL 容量瓶中, 并稀释至刻度, 摇匀。 若提 取液澄清透明, 则可直接取样测定, 若有浑浊现象, 可通过离心来消除。 样液的测定 准确移取澄清透明的 0.10.5mL 提取液, 置于 10mL 的比色 管中,用 2 偏磷酸稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比, 在波长 243nm 处, 用 1cm 石英皿测定其吸光度。 样液的测定 准确移取澄清透明的 0.10.5mL 提取液, 置于 10mL 的比色 管中, 用 2 偏磷酸稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比, 在波长 243nm 处, 用 1cm 石英皿测定其吸光度。 待测碱处理样液的测定 分别吸取 0.10.5mL 澄清透明提取液, 加入 6 滴 0. 5mol/ L 氢氧化钠溶液, 置于 10mL 比色管中混匀, 在室温放置 40m in 后, 加入 2 偏磷酸稀释至刻度后摇匀。 以蒸馏水为参比,在波长 243nm 处测 定其吸光度。 3.2．3 结果计算 由待测样品与待测碱处理样品的吸光值之差查校准曲线, 即可计算出样品 中维生素 C 的含量, 也可直接以待测碱处理液为参比, 测得待测液的吸光值, 通过查校准曲线, 计算出样品的维生素 C 的含量。 维生素 C 的含量的计算公式如下 其中 m 样品重量, g； 200稀释倍数； C从校准曲线上查得抗坏血酸的含量, g/ mL； V 测试时吸取提取液体积,mL。 3.3 结果与讨论 3.3.1 反应条件选择 3.3.1.1 测定波长的选择 维生素 C 是烯醇化合物,具有CC基,在可见区无吸收,在紫外区有吸收, 按实验方法,分别对不同浓度的维生素 C 与试剂空白溶液在 200400nm 波长范 围内进行扫描, 结果见图 1。 由紫外吸收光谱图表明, 最大吸收峰在 243nm。 因此, 选 243nm 作为测量波长。 3.3.1.2 溶剂的选择 由于维生素 C 极不稳定, 在样品前处理过程中, 防止抗坏血酸的氧化是非 常重要的。可采用添加偏磷酸、草酸的方法加以解决。因为它们均能抑制抗坏 血酸的氧化酶,而起稳定作用。但由于 2草酸在波长 243nm 处有以不能作为维 生素 C 的提取液,而 2偏非常强的吸收, 所磷酸虽然在波长 243nm 处有微弱的 吸收, 见图 1, 可通过扣除其空白吸光值, 便可计算出样品维生素 C 的吸光值 △A 。 因此, 本实验选择 2偏磷酸作为分光光度法的溶剂。 图 4 不同浓度维生素 C 紫外吸收光谱 12 偏磷酸； 26.0g/ mL 维生素 C； 312.0g/ mL 维生素 C 3.3.1.3 静置时间的选择 根据维生素 C 在碱性介质中不稳定, 易分解的特性, 经过实验表明, 水果、 蔬菜提取液加碱后的静置时间与浸提液取样量有关。笔者以本测试方法最大取 样量 0. 5mL 做实验,加入碱液后室温放置时间与吸光度之间的关系, 结果见表 1, 可知在室温放置 3590m in, 吸光度达最小值且稳定, 故选择静置 40min。 表 1 静置时间与吸光度 A 关系 时间 tm in 5101520253035406090 吸光 度 A 0. 4142 0. 3863 0. 3670 0. 3652 0. 3645 0. 3600 0. 3588 0. 3590 0. 3587 0. 3589 3.3.1.4 NaOH 试剂用量选择 水果加碱量与提取液的取样量有关, 当提取液取样量≤0. 5mL 时, 加入 6 滴约 0. 3mL 0.5mol/L N aOH 溶液,溶液呈碱性pH 值10,利用维生素在碱 性介质中不稳定特性,达到破坏维生素 C 的目的。若碱液加入量过大, 会影响 最终测定液的酸碱度, 故选加入