CRI系统反硝化细菌的筛选及脱氮性能研究.pdf

CＲI 系统反硝化细菌的筛选及脱氮性能研究 * 骆灵喜1， 2刘欢1， 2王枫2赵振业1裴廷权1李旭宁 1， 2 1. 深圳市海岸与大气研究重点实验室， 广东 深圳 518000; 2. 深圳市深港产学研环保工程技术股份有限公司， 广东 深圳 518000 摘要 从深圳市白芒污水处理厂的人工快渗 CＲI 系统筛选出 6 株反硝化细菌， 通过细菌 16S rDNA 序列的测序和比 对， 并结合细菌的形态和生理学特征， 基本确定 F11 菌株为布鲁菌属 Brucella sp． ， F12、 F53 菌株为苍白杆菌属 Ochrobactrum sp． ， F21 菌株为灿烂类芽孢杆菌 Paenibacillus lautus ， F31 菌株为蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus ， F51 菌株为纤维化纤维菌 Cellulosimicrobium cellulans ; 同时， 在初始浓度为 106单位/mL 的条件下， 经过 12 d 的脱氮性能 检测， 其对硝态氮的平均去除率为 71左右。对未来制备反硝化菌剂和加强 CＲI 系统的脱氮能力奠定了基础。 关键词 CＲI 系统; 反硝化细菌; 筛选; 脱氮性能; 鉴定 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201404003 SCＲEENING AND DENITＲIFICATION PEＲFOＲMANCE OF DENITＲIFYING BACTEＲIA IN CONSTＲUCTED ＲAPID INFILTＲATION SYSTEM Luo Lingxi1， 2Liu Huan1， 2Wang Feng2Zhao Zhenye1Pei Tingquan1Li Xuning1， 2 1. Shenzhen Key Laboratory for Coastal and Atmospheric Ｒesearch， Shenzhen 518000，China; 2. Shenzhen- Hongkong Institution of Industry，Education ＆ Ｒesearch Environmental Engineering Technique Co． ， Ltd， Shenzhen 518000，China AbstractSix strains of denitrifying bacteria were screened from constructed rapid infiltration CＲIsystem of Shenzhen Baimang Sewage Treatment Plant． When the inoculation concentration was 106unit/mL and went through the reaction of nitrogen removal for 12 d，the average removal rate of NO3－ N of these 6 denitrifying bacterial strains was 71． Through sequencing and comparison of bacterial 16S rDNA sequences，and combined with the bacterial morphology and physiological characteristics，strain F11 was identified as Brucella sp． ，strain F12 and strain F53 were identified as Ochrobactrum sp． ， strain F21 was identified as Paenibacillus lautus，strain F31 was identified as Bacillus cereus，strain F51 was identified as Cellulosimicrobium cellulans． Which provides a basis for preparation of denitrifying bacteria and strengthening the ability of nitrogen removal in CＲI system． KeywordsCＲI system;denitrifying bacteria;screening;denitrification perance;identify * 深圳市战略新兴产业发展专项资金资助 ZDSY20120618162015166 。 收稿日期 2013 －07 －15 0引言 人工快速渗滤系统 Constructed Ｒapid Infiltration System， 简称 CＲI 系统 是在传统土地处理系统的基 础上发展起来的新型污水处理技术， 有效地克服了传 统土地处理法水力负荷较低、 占地面积大等缺点。该 系统利用渗透性能较好的天然河砂和一定比例的特 殊矿物填料， 以干湿交替的运行方式， 使污水在自上 而下流经填料过程中发生综合的物理、 化学、 生物反 应， 使污染物得以去除［1- 2 ］， 现已主要用于中小城镇生 活污水处理 ［3- 4 ］、 农村污水处理及面源污染防治、 城市 和工业园区污水处理［5 ］、 受污染河道生态修复 ［6- 8 ］及 污水资源化 ［9- 10 ］等领域， 对于我国中小城镇和农村地 区的污水处理具有较高的应用价值。 在 CＲI 系统中， 氮类污染物的最终去除是靠渗 滤池内的除氮微生物来完成的， 有机氮被吸附在填料 颗粒表面后， 首先被氨化细菌分解为氨氮， 氨氮在亚 硝酸细菌和硝酸细菌作用下被氧化为硝氮， 最后硝氮 通过反硝化作用还原成 N2或 N2O 逸出［11- 12 ］。氮类 污染的最终去除基本都需要经过微生物的反硝化反 应， 研究表明 CＲI 系统中反硝化菌的数量大概在 9 水污染防治 Water Pollution Control 104～106单位/mL［13- 14 ］。到目前为止， 尚未有 CＲI 系 统反硝化细菌的分离、 鉴定与脱氮性能的研究报道。 通过对 CＲI 系统中反硝化菌进行筛选和脱氮性能研 究， 有助于更深入分析 CＲI 系统的脱氮能力， 也可将 筛选出的反硝化细菌制备成菌剂， 从而加强 CＲI 系 统的脱氮能力。 1实验部分 1. 1实验材料 1. 1. 1样品来源 待分离的反硝化细菌来自深圳市白芒污水处理 厂 CＲI 池填料。 深圳市白芒污水处理厂是深圳西丽水库入库支 流水环境治理工作的重要组成部分， 处理规模 10 000 t/d， 于 2007 年 1 月正式投入运行。该工程污 染物削减负荷为 有机物削减量约为 252 t/a， 总氮削 减量约为16 t/a， 总磷削减量约为1. 85 t/a， 极大地改 善了河流水质， 对保护深圳市四大水缸之一的西丽水 库作用显著。 1. 1. 2培养基 反硝化菌富集培养基［15 ］ KNO32. 0 g， MgSO4 7H2O 0. 2 g， K2HPO40. 5 g， 酒石酸钾钠 20 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 7. 2。 固体分离培养基 在液体富集培养基中加入质量 分数为 2的琼脂。 需氧性测定培养基 蛋白胨 10 g， 酵母膏 5 g， 葡 萄糖 1 g， 琼脂 15 g， 蒸馏水 1 000 mL。 1. 1. 3主要试剂与仪器 格里斯试剂 ［15 ］ A 液 0. 5 g 的对氨基苯磺酸加 入到 150 mL 的 20稀醋酸溶液中; B 液 1 g 的 a- 萘 胺加入到 20 mL 蒸馏水和 150 mL 的 20 稀醋酸溶 液中。 二苯胺试剂 ［15 ］ 0. 5 g 无色的二苯胺加入到 20 mL蒸馏水及 100 mL 浓硫酸中。 革兰氏染色液 草酸铵结晶紫、 卢戈碘液 Lugol solution 、 95乙醇、 蕃红。 主要仪器 PTC- 100 PCＲ 仪 Bio- Ｒad 公司 ; BX- 41 荧光显微镜 Olympus 公司 ; UNIC 型分光光度计 上海优尼科科学器材公司 ; FA 型分析天平 上海 精密科学仪器有限公司 。 1. 2实验方法 1. 2. 1反硝化菌的富集、 分离和纯化 取 1 mL CＲI 填料的悬液加入装有 20 mL 反硝化 细菌富集培养基的试管中， 在 30 ℃ 恒温密闭培养 5 d; 再取 1 mL 富集培养液接入新鲜富集培养液， 继 续培养并进行上述测试。经过 2 次富集培养后， 吸取 40 μL 富集液在固体分离培养基上进行稀释涂板， 30 ℃恒温培养 3 ～ 5 d 后， 挑取不同形态、 质地、 边 缘、 光学特性、 颜色的菌落， 进行 3 次纯化和分离。 1. 2. 2反硝化菌的脱氮性能研究 将分离纯化的菌株分别接种于液体富集培养基 中， 在30 ℃条件下密闭培养5 d。将菌液6 000 r/min 离心 10 min， 取沉淀用生理盐水重悬， 菌悬液采用细 菌荧光染液 Live/Dead Baclight Baterial Viability Kit Invitrogen 公司 染色法和血细胞计数法［9 ］确定菌悬 液的细菌浓度。 将菌悬液接种至20 mL NO － 3 －N 浓度为100 mg/L 的反硝化菌富集培养基中， 并使菌体初始浓度为 106单位/mL， 在 30 ℃、 130 r/min 的条件下， 摇床振 荡培养， 每日同一时间测量溶液中 NO － 3 － N、 NO － 2 － N、 NH3－ N 的质量浓度， 分析菌株的处理效率。 NO － 3 － N、 NO － 2 － N、 NH3－ N 的含量分别采用酚 二磺酸光度法、 N- 1- 萘基 - 乙二胺光度法、 纳氏试剂 光度法进行测定。 1. 2. 3反硝化细菌的 16S rDNA 测序和比对 采用 MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 宝生物工程有限公司 试剂盒提取细菌基因组 DNA， 并以基因组 DNA 为模板扩增 16S rDNA， 正反 向引物分别为 16S rDNA- 27f 5- GAGAGTTTGATCCT GGCTCAG- 3， 16S rDNA- 519r 5- GWATTACCGCGGC KGCTG- 3。PCＲ 反应体系 50 μL 模板 DNA 50 ～ 100 ng， PCＲ Premix 25 μL， 上下游引物各0. 5 μL， 加 ddH2O 至反应体系为50 μL。PCＲ 程序 94 ℃ 10 min， 94 ℃ 1 min， 50 ℃ 1 min， 72 ℃ 2 min， 72 ℃ 5 min; 72 ℃ 10 min; 30 个循环 ［16 ］。PCＲ 产物的纯化和测序 由华大基因公司完成， 测序序列登录 GenBank 进行 同源性序列比对分析。 1. 2. 4反硝化菌的系统进化树 将菌株 16S rDNA 序列与从 GenBank 数据库中 高相似度细菌的序列一起， 运用 BIOEDIT 和 MEGA 软件进行序列排比， 通过自举分析 boostrap 进行置 信度检测， 自举数据集为 1 000 次， 用 Neighbour- Joining 法构建细菌的系统树［17 ］。 1. 2. 5反硝化细菌的形态及生理生化特性检测 菌株的形态特征、 培养特性、 生理生化的鉴定方 01 环境工程 Environmental Engineering 法等参考 土壤与环境微生物研究法 ［18 ］。 2结果与分析 2. 1反硝化细菌脱氮性能检测结果 本研究从 CＲI 的填料中分离出6 株反硝化菌， 其 对硝态氮的去除率如图 1 所示。由图 1 可知 经过 12 d 的反应， 6 株反硝化菌对硝态氮平均去除率为 71左右， 其中菌株 F12 显示出较高的去除率， 12 d 可去除 78左右的硝态氮。本实验结果与张春杨等 从印染厂的污水处理系统中分离出来的一株反硝化 菌的脱氮效果相似， 该菌可在 60 h 内去除 NO － 3 － N 10. 43 ～13. 13［ 19 ］。刘咏等人曾将分离的 Klebsiella sp． DB- 1 进行活性检测， 结果显示该菌能在 120 h 内 将 100 mg/L 的硝态氮基本去除 ［20 ］; 陈朋从南四湖植 物芦竹根际土壤中筛选出一株反硝化细菌 LZ- 14， 36 h内可将 150 mg/L 硝态氮完全去除， TN 去除率可 达 84. 5［21］。造成反硝化菌去除效果差异的原因 除了是菌株的去除能力有差异之外， 细菌的数量也 是一个重要的影响因素。张小玲等认为将反硝化菌 体浓度达到 108cfu/L 时， 其反硝化活性即可充分发 挥， 硝态氮和亚硝态氮的降解率可分别达 94. 79 和 99. 94［22 ］。 图 1反硝化菌对硝态氮的去除率 Fig．1Nitrate removal of denitrifying bacteria 另外， 如图 2 和图 3 所示， 在反硝化菌去除硝态 氮的同时会产生少量的亚硝态氮和氨氮的积累， 但是 含量极少， 可忽略不计， 绝大部分硝态氮可实现去除。 2. 2反硝化细菌的 16S rDNA 测序与鉴定 利用菌种的 16S rDNA 的序列， 在 NCBI 数据库 图 2反硝化菌脱氮过程中亚硝态氮的积累 Fig．2Concentration of accumulated nitrite- nitrogen in denitrifying process of denitrifying bacteria 图 3反硝化菌脱氮过程中氨氮的积累 Fig．3Concentration of accumulated nitrite- nitrogen in denitrifying process of denitrifying bacteria 进行 Blast 分析， 并结合以上细菌的形态和生理学特 征， 确定与分离细菌最相似的菌株种类的信息， 结果 如表 1所示。系统发育树如图 4 所示。基本确定 F11 菌株为布鲁菌属 Brucella sp． ， F12、 F53 菌株为苍白 杆菌属 Ochrobactrum sp． ， F21 菌株为灿烂类芽孢杆 菌 Paenibacillus lautus ， F31 菌株为蜡状芽孢杆菌 Bacilluscereus ，F51 菌 株 为 纤 维 化 纤 维 菌 Cellulosimicrobium cellulans 。其中蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 已有较多反硝化相关研究［23- 27 ］， 具有 反硝化作用的布鲁菌属 Brucella sp． ［28 ］、 苍白杆菌 属 Ochrobactrumsp． ［29 ］、灿 烂 类 芽 孢 杆 菌 Paenibacillus lautus ［30 ］也有相关的报道， 但是纤维 化纤维菌 Cellulosimicrobium cellulans 暂时并未发现 11 水污染防治 Water Pollution Control 有脱氮相关的研究。 表 1 CＲI 池反硝化细菌 16S rDNA 测序比对结果 Table 1Analysis result of 16S rDNA of denitrifying bacteria in CＲI pond 反硝化细菌 GenBank 登录号 相似度/最相似细菌 F11FJ555566. 192Brucella sp． F12JX989250. 199Ochrobactrum sp． F21HM462433. 1100Paenibacillus lautus F31AB809566. 1100Bacillus cereus F51KC660138. 1100Cellulosimicrobium cellulans F53JX393011. 1100Ochrobactrum tritici 注 圆括号内为 GenBank 中的收录号， 每个分支点处的 数字为 Bootstrap 的支持百分率 图 4 CＲI 池反硝化细菌 16S rDNA 序列系统发育树 Fig．4The phylogenetic tree of 16S rDNA of denitrifying bacteria in CＲI pond 2. 3反硝化细菌的形态及生理生化特性 6 株反硝化菌的形态和部分生理生化特性如表 2 和表 3 所示， 基本与表 1 中 16S rDNA 序列比对结果 的反硝化菌种特性相一致。 3讨论 据监测数据显示， CＲI 系统出水中仍有 10 mg/L 左右的硝态氮 ［31 ］， 主要原因可能有两点 1 由于 CＲI 系统采用干湿交替的运行方式， 污水经过 1 h 左右的 布水期后便排出水口， 污水中的硝态氮并未完全被 CＲI 系统中的生物膜吸附和吸收。2 CＲI 系统中的 反硝化作用较弱 由于反硝化作用需要同时具有高效 反硝化细菌、 硝态氮、 碳源以及厌氧条件才能够很好 表 2反硝化硝酸菌株个体形态和菌落特征 Table 2Morphological and colonial characteristics of denitrifying bacteria 项目F11F12F21F31F51F53 形状短杆状 短杆状杆状杆状短杆状 短杆状 革兰氏反应 －－ － 鞭毛无周生鞭毛 周生鞭毛 无无周生鞭毛 芽孢无无有有无无 荚膜有有有有有有 菌落形状圆圆圆圆圆圆 颜色乳黄色 乳白色乳黄色乳黄色 乳黄色 乳白色 光泽度光滑光滑不光滑不光滑 光滑不光滑 黏稠度黏稠不黏稠不黏稠不黏稠 黏稠黏稠 隆起形状平平平凹凹凹 边缘情况整齐整齐整齐整齐整齐不整齐 透明度不透明 透明透明透明不透明 不透明 表 3反硝化菌株的部分生理生化反应 Table 3Physiological and biochemical properties of denitrifying bacteria 项目F11F12F21F31F51F53 葡萄糖 产酸 产气－－－ 蔗糖产酸－ 产气－－－ 乙醇产酸－－－－ 产气－－－－－－ 需氧性兼性厌氧 微好氧 兼性厌氧 兼性厌氧 微好氧兼性厌氧 地进行， 但是人工快渗池的上部有反硝化细菌、 有机 碳源和硝态氮， 但缺少厌氧条件; 快渗池下部有反硝 化功能菌和较好的厌氧条件， 但缺少碳源， 故导致 CＲI 系统的反硝化反应不够理想。 根据上述影响反硝化反应的环境因素分析， 建议 采取以下措施提高 CＲI 系统反硝化能力 1 分离、 筛选 适合在快渗系统内生长的反硝化细菌， 制成反硝化功 能菌剂， 加入 CＲI 系统， 以提高系统内反硝化细菌的数 量。2 增加碳源。考虑到 CＲI 系统的水力负荷、 运行 成本、 工程能耗等问题， 建议向人工快渗反硝化细菌较 丰富的最下层填料中投加适量成本较低的缓释碳源。 3 将快渗处理单元的出水以一定比例回流至初沉池。 之所以考虑此种方法是由于快渗池出水中NO － 3 - N含量 相对较高， 而原污水中有机碳较多， 将两水混合后， 可 有利于达到反硝化反应进行的条件。 4结论 1 本研究从 CＲI 的填料中分离出 6 株反硝化 菌， 经过 12d 的脱氮性能监测， 接种浓度为 106单位/ mL 的 6 株反硝化菌对硝态氮的平均去除率为 71 21 环境工程 Environmental Engineering 左右， 其中菌株 F12 显示出较高的去除率， 12d 可去 除 78左右的硝态氮。 2 利用菌种的 16rDNA 的序列并结合以上细菌 的形态和生理学特征， 基本确定 F11 菌株为布鲁菌属 Brucella sp． ，F12、F53 菌 株 为 苍 白 杆 菌 属 Ochrobactrum sp． ， F21 菌株为灿烂类芽孢杆菌 Paenibacillus lautus ， F31 菌株为蜡状芽孢 杆 菌 Bacilluscereus ，F51 菌 株 为 纤 维 化 纤 维 菌 Cellulosimicrobium cellulans 。 参考文献 ［1］何江涛，钟佐燊， 汤鸣皋． 解决污水快速渗滤土地处理系统占 地突出的新方法［ J］ ． 现代地质， 2001， 15 3 339- 345. ［2］何江涛，钟佐燊，汤鸣皋， 等． 人工构建快速渗滤污水处理系 统的试验［J］． 中国环境科学， 2002， 22 3 239- 243. ［3］司圣飞，陈永青， 刘康怀． 人工快渗处理城镇污水的优化技术 研究［J］． 给水排水， 2011， 37 235- 238. ［4］蒲贵兵，吕波， 何东． 三峡库区乡镇生活污水人工快渗处理中 的氮素转化［J］ ． 水资源保护， 2011， 27 1 34- 45. ［5］汪洋． 复合填料人工快渗系统处理化工尾水的实验研究［D］． 合肥合肥工业大学， 2010 61- 62. ［6］牟新民，黄培鸿，张金炳， 等． 人工快速渗滤系统处理深圳市 茅洲河水的试验研究［J］ ． 应用基础与工程科学学报，2003， 11 4 370- 376. ［7］潘彩萍， 王小奇． 人工快渗处理牛湖河水的实践［J］． 中国给 水排水， 2004， 20 9 71- 72. ［8］张金炳，张永华，杨小毛， 等． 用人工快速渗滤系统处理受污 染河水的试验研究［J］ ． 华北水利水电学院学报，2004， 25 3 65- 67. ［9］何江涛，钟佐燊，汤鸣皋， 等． 污水土地处理技术与污水资源 化［J］． 地学前缘， 2001， 8 1 155- 161. ［ 10］张国臣，陈鸿汉，何江涛， 等． 人工快速渗滤系统在城市雨水 资源化中的应用［ J］ ． 环境保护， 2008， 39 4 76- 78. ［ 11］Ma L，Sun X，Liang X， et al．Biological nitrogen removal by nitrification- denitrification in constructed rapid infiltration land system totreatmunicipalwastewaterJournalofFood ［J］． Agriculture ＆ Environment， 2009， 7 3 795- 798. ［ 12］Wen L X，Jian Q Z，Yun L． NH3- N degradation dynamics and calculating model of filtration bed height in constructed soil rapid infiltration［J］． Chinese Geographical Science，2011，21 6 637- 645. ［ 13］崔程颖，马利民， 赵建夫． 人工快速渗滤系统微生物特征研究 ［C］∥2008 中国可持续发展论坛论文集 2 ． 杭州 中国人 口 资源与环境 编辑部， 2008 539- 542. ［ 14］喻治平，赵智杰， 杨小毛． 人工快速渗滤池微生物活性的研究 ［J］． 中国环境科学， 2005， 25 5 591. ［ 15］许光辉， 郑洪元． 土壤微生物分析方法手册［M］． 北京农业 出版社， 1986 251- 255， 287- 291. ［ 16］Gerard M，Ellen C D W，Andre G U．Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction- amplified genes coding for 16S rＲNA［J］． Applied and Environmental Microbiology，1993， 59 3 695- 700. ［ 17］Jason E，Luke S，James F．Ｒelaxed neighbor joiningA fast distance- based phylogenetic tree construction ［J］． Journal of Molecular Evolution， 2006， 62 6 785- 792. ［ 18］李振高，骆永明， 滕应． 土壤与环境微生物研究法 ［M］． 北 京科学出版社， 2008 101- 103. ［ 19］张春杨， 张丽丽． 一株反硝化细菌的分离及其反硝化特性［J］． 安徽农业科学， 2008， 36 3 872- 873. ［ 20］刘咏，钱家忠，魏兆军， 等． 反硝化细菌 Klebsiella sp． DB- 1 的 分离鉴定与活性研究［J］． 中国科学技术大学学报，2011， 41 1 16- 21. ［ 21］陈朋． 反硝化细菌的筛选、 鉴定及其强化处理硝酸盐废水的研 究［D］． 山东 山东大学， 2009 33- 48. ［ 22］张小玲， 梁运祥． 一株反硝化细菌的筛选及其反硝化特性的研 究［J］． 淡水渔业， 2006， 36 5 28- 32. ［ 23］安健，伏光辉，阮记明， 等． 反硝化除磷菌筛选及其特性研究 ［J］． 微生物学通报， 2012， 39 2 162- 171. ［ 24］尹明锐，汪苹，刘健楠， 等． 具有 N2O 控逸能力的异养硝化- 好 氧反硝化菌株的筛选鉴定［J］． 环境科学研究，2010，23 4 516- 520. ［ 25］廖小红，汪苹，刁惠芳， 等． 蜡状芽孢杆菌 WXZ- 8 的异养硝 化/好氧反 硝 化 性 能 研 究［J］．环 境 污 染 与 防 治，2009， 31 7 17- 20. ［ 26］杨希，刘德立，邓灵福， 等． 蜡状芽孢杆菌好氧反硝化特性研 究［J］． 环境科学研究， 2008， 21 3 156- 159. ［ 27］尹明锐，汪苹，廖小红， 等． 异养硝化- 好氧反硝化菌 W X Z- 8 的脱氮产物 N2O 和 N2研究［J］． 环境科学与技术，2010， 33 8 16- 19. ［ 28］仲汇慧，张晓君， 岳思青． 喹啉废水反硝化反应器中优势菌的 代谢功能分析［J］． 微生物学通报， 2010， 37 5 645- 650. ［ 29］林娜，郭楚玲，柯林， 等． 富营养化池塘中好氧反硝化菌的分 布及脱氮研究［J］． 中国科技论文在线， 2010， 5 5 369- 372. ［ 30］孙伟． 三种厌氧功能菌株的分离鉴定和系统发育分析［D］． 哈 尔滨 哈尔滨工业大学， 2008 42- 57. ［ 31］王枫，骆灵喜，刘欢， 等． 人工快速渗滤系统中人工快渗池对污 染物的去除效果研究［ J］ ． 环境污染与防治， 2013， 35 5 60. 第一作者 骆灵喜 1985 － ， 男， 工程师， 主要研究方向为水环境治理 技术研发。luolingxi qq． com 通讯作者 李旭宁， 男， 主任工程师， 主要研究方向为污水处理技术与 装置研发。29213627 qq． com 31 水污染防治 Water Pollution Control