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第第 19 卷卷 第第 4 期期 湖湖 南南 文文 理理 学学 院院 学学 报（自报（自 然然 科科 学学 版）版） Vol. 19 No. 4 2007 年年 12 月月 Journal of Hunan University of Arts and ScienceNatural Science Edition Dec. 2007 文章编号文章编号1672-6146200704-0058-04 锰污染稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性研究锰污染稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性研究 刘云国, 周海舟, 冯宝莹, 樊 霆, 潘 翠 湖南大学 环境科学与工程学院, 湖南 长沙 410082 摘摘 要要 采集了湖南省湘潭市锰矿尾渣坝附近受不同程度锰 污染的 7 个水稻田土壤样品，总锰浓度范围为 1144 611 mg/kg. 提取土壤细菌总 DNA，用通用引物对其中的 16S rDNA 进行扩增，然后进行变性梯度凝胶电泳Denaturing Gradient Gel Electrophoresis， 分析长期受锰污染的水稻田土 壤微生物群落结构和遗传多样性变化， 存在于污染最严重样 点中的细菌种群对锰有较高的耐受性， 不同锰污染的样点群 落结构发生变化并且有菌种的消亡和新菌种的产生. 锰污 染直接和间接地改变了水稻田土壤微生物群落结构和遗传 多样性. 关键词关键词锰；微生物群落；遗传多样性；16Sr DNA；DGGE 中图分类号中图分类号X 53; X 503.2 文献标识码文献标识码A 开采矿山产生的重金属污染引发了一系列环境 问题[1]. 重金属对环境及生态系统有长期的毒性而 且容易在生物体内积累形成一系列毒害[2]. 土壤重 金属污染与微生物群落之间的关系一直是土壤重金 属污染生态评价中的热点问题[3]. 许多研究报道重 金属污染能明显影响微生物群落的生物量、活性及 结构组成[4]. 但由于大部分土壤微生物的培养环境 未知或者在现有技术下无法达到，传统的分离培养 方法很难全面的评估微生物群落的多样性[5]. 近年 来，通过提取土壤微生物总 DNA，扩增 16S rDNA 序列的变性梯度凝胶电泳DGGE分析被广泛应用 于考察重金属胁迫下微生物的遗传多样性和群落结 构变化，可有效避免富集、培养、分离研究过程中 造成微生物多样性的丢失,种群构成发生变化等弊 病,能够更直接更可靠地反映土壤微生物的组成情 况[3]. 锰是一种环境神经毒素，能导致动物锰中毒 和帕金森综合症[6]， 对植物也有毒害性[7]. 但是关于 自然环境中长期锰污染影响土壤微生物群落遗传多 样性的研究并不多见. 本研究选择了湘潭锰矿尾渣 坝附近长期受以锰为主要污染物污染的水稻田土 壤，研究锰污染对其中微生物群落结构及遗传多样 性的影响. 1 实验实验 1.1 土壤样品采集土壤样品采集 湘潭锰矿位于湘潭北郊，属于典型的亚热带大 陆性气候， 温暖、 湿润、 四季分明， 年均气温 17.4 ℃， 年均降雨量 1 431.4 mm. 开采历史已有九十余年. 土样采集自锰矿尾渣坝北面的水稻田，距离尾渣坝 0.01，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 和 4 km 处分别取样， 并且对应地编号为 S1，S2，S3，S4，S5，S6 和 S7. 在每个采样点，随机取 8 处土壤表层 1520 cm 土 样混合. 采集的土样带回实验室并储存在-20 ℃条 件下等待做进一步的分析. 1.2 土壤化学性质及重金属含量分析土壤化学性质及重金属含量分析 土样的 pH 值用 pH 计直接测定. CEC 采用 Ba2 饱和法测定. 土壤有机碳和总氮用总碳测定仪 TOC-500和凯氏定氮仪分别测定. 土样中的重金 属含量分析采用 HCl-HNO3-HClO4混合消解，火焰 原子吸收分光光度法测定. 土壤有效态重金属用 DTPA 溶液0.005 mol 二乙烯三胺五乙酸，0.01 mol 氯化钙,0.1 mol 三乙醇胺浸提，浸出液中的重金属 用火焰原子吸收分光光度法测定. 分析结果见表 1. 表表 1 不同样点土壤样品的化学性质和锰含量不同样点土壤样品的化学性质和锰含量 土样号 距离 /km pH CEC /cmolkg-1 总 Mn /mgkg-1 有效态 Mn /mgkg-1 有机 C /gkg-1 总 N /gkg-1 C׃N S1 0.01 7.940.16 8.40.5 4 6113091 25821525.12.63.060.20 8.2 S2 0.2 7.630.10 8.20.4 1 765136 5304128.22.52.940.20 9.6 S3 0.6 6.750.13 10.21.1 95467 3801731.92.93.030.18 10.5 S4 1 6.460.09 9.61.0 71842 302 9 34.90.83.680.13 9.5 S5 1.4 6.590.12 12.91.3 59341 2611434.52.43.560.18 9.7 S6 1.8 6.330.07 13.61.2 55630 2401733.62.13.630.15 9.3 S7 4 5.850.06 11.21.1 11415 617 29.83.02.990.28 10.0 表中数值为 3 个样品的算术平均值和其标准差. 第 4 期 刘云国, 周海舟, 冯宝莹, 等 锰污染稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性研究 59 1.3 土壤总土壤总 DNA 的提取和纯化的提取和纯化 采用经改进的 CTAB十六烷基三乙酸溴化铵 化学裂解法[8,9]直接从土壤里提取细菌总 DNA. 将 0.5 g 土样与 3 mL 120 mmol 磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，离心分离倒去上清液后加入 1 mL 0.1 mol 的 DNA 提取液Tris-HCl, 0.1 mol EDTA, 0.1 mol 磷酸 盐，1.5 mol NaCl, 1 CTAB和 20 L 10 mmol 的蛋 白酶 K，37 ℃水浴摇床震荡 30 min. 之后加入 150 L SDS20，65 ℃水浴 2 h，每 20 min 倒置一次. 6 000g 离心分离 10 分钟，将上清液转移到新的离 心管与等体积氯仿-异戊醇241 v/v混合. 离心分 离后抽提上清液，加入 0.6 倍体积异丙醇沉淀 1 h， 16 000g 离心 20 min，弃上清，加入 0.5 mL 冰预 冷的 70乙醇洗涤沉淀，离心后弃上清，沉淀自然 风干， 溶于 80 L TE 缓冲液. 结果用紫外分光光度 计DU-640, Beckman检测 DNA 纯度. 1.4 PCR 扩增扩增 用于16S rDNA的PCR扩增反应的引物为一对 通用引物[10] 341F-GC5-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCC CCG CCC GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3和 907R5-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3. 其中 341F 的 5端加入 GC 夹 以增加 DNA 双解链区的数量. 反应体系5 L 的 10PCR 缓冲液含 MgCl2，0.5 L 模板，2 L 10 mmol dNTPs，1 U 的 Pfu DNA 聚合酶，0.5 L 的 10牛血清白蛋白，正反引物各 1 L，加超纯水至 50 L. 反应在 GenAmpTM PCR System 9700 Applied Biosystems 中进行，设定条件为94 ℃预变性 5 min 后，94 ℃变性 40 s，53 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 60 s，共 35 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min. 取 5 L PCR 产物在 1TAE 琼脂凝胶0.8 w/v上电泳后， 用 溴化乙啶染色检测. 1.5 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳DGGE DGGE 所用仪器为 The DcodeTM Universal Mutation Detection System Bio-Rad. 电泳所用胶 浓度为 6丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰铵 37.51， 其变 性梯度范围为 4570100的变性剂中含有 7 mol的尿素和40的去离子甲酰胺， 上样量为35 L 的 PCR 产物. 运行条件为在 1TAE 电泳缓冲液 中，55 ℃条件下，140 V 运行 16 h. 电泳完成后， 用溴化乙啶染色 1 h，用凝胶成像系统Gel Doc 2000TM, Bio-Rad观察结果，Bio-Rad Quantity One 软件分析图谱. 2 结果与讨论结果与讨论 2.1 土壤化学性质和锰含量土壤化学性质和锰含量 土壤化学性质和锰含量见表 1. 经过约 90 年的 时间，锰已经成为锰矿周围水稻田土壤中最主要的 重金属污染物. 总锰含量的变化范围为 1144 611 mg/kg，随着样点离锰矿尾渣坝距离越远，含量越 少. 有效态锰含量范围为 611 258 mg/kg，变化趋 势与总锰含量一致. 2.2 土壤微生物总土壤微生物总 DNA 的提取的提取 土壤总 DNA 提取结果表明，各样点土壤的 DNA片段在 23 kb左右， 适合土壤微生物16S rDNA 分析，土样 DNA 的 A260/A280 比值在 1.62 到 1.82 之间通常情况下样本 DNA 的 A260/A280 值在 1.752.1 之间，具有良好的可比性. 经过 PCR 后， 均获得长度为 560 bp 左右的特异扩增片段，用于 DGGE 分析，结果如图 1 所示. 图图1 7个样点土壤微生物个样点土壤微生物16S rDNA的的PCR-DGGE指纹图谱指纹图谱 2.3 锰污染土壤微生物群落遗传多样性锰污染土壤微生物群落遗传多样性 变性梯度凝胶电泳结果如图 1 所示，可见 16S rDNA PCR 产物在梯度变性凝胶上被分离. DGGE 根据 DNA 解链行为的不同，可以分离具有相同长 度但是碱基对序列不同的 DNA. 图像泳道中被分 离的每一个条带理论上可代表样品微生物群落中的 一种细菌，条带的浓度代表了细菌数量的多少[11]. 结果显示 7 个土样的图谱在条带的数目和位置上有 一定的差异. 与对照土样S7相比， 低浓度锰胁迫时 556954 mg/kg，图谱中 S6 到 S3 条带数量变化不 大，表明稻田土壤中绝大多数微生物对低浓度锰有 一定的耐受性. 而 S3 土样中新增条带图 1 中 A 处 的出现，说明某些微生物类群对于环境锰浓度有较 高的选择性，这些特征性微生物的出现可以作为稻 田土壤受某浓度范围锰胁迫的指示菌. 个别种群对 锰胁迫较敏感，随着锰浓度的增加，个体数量大大 降低，达到 DGGE 分辨率下限，致使条带变暗甚至 消失. 到土壤锰浓度为 1 765 mg/kg 时S2，整个泳 60 湖 南 文 理 学 院 学 报（自 然 科 学 版） 2007 年 道条带出现明显差别，在锰浓度为 4 611 mg/kg 的 S1，条带数量更是降到了最低的 6 条，表明土壤微 生物丰富度richness减少. 在所有 7 个泳道中都出 现的 6 条条带，不仅广泛存在于各个低浓度锰污染 的样点，而且对高浓度锰也有较高的耐受性，在各 样点微生物群落中处于优势地位，对环境的变化有 较强的适应性. 用 UPGMAThe unweighted pair group with arithmetic averages算法对图谱作出系统树状 图图 2说明微生物群落的同源性. 7 个样品共分为 三大族群. 样点 S1 和 S2 归为一族，与其他各样点 相似性最低. S3 和 S4 归为一族，S5，S6 和 S7 归为 一族. 其中 S7 又与 S5 和 S6 分离开， 归为单独的一 族. 这说明随着离锰矿尾渣坝距离的增加，锰污染 的变化，土壤微生物群落结构有一个逐渐演替的过 程. 图图 2 基于不同浓度锰污染土壤微生物遗传簇聚类分析基于不同浓度锰污染土壤微生物遗传簇聚类分析 DGGE 结果表明，不同程度的锰污染对供试土 壤微生物的组成产生了明显的影响，土样微生物群 落遗传多样性存在差异. 不同程度的锰污染不仅影 响了组成微生物群落的细菌种群数目，还使微生物 群落结构以及优势种群发生了改变. 这说明土壤微 生物群落中各个种群是相互作用的，各样点微生物 群落的遗传多样性是基于种群的群体性反映. 不同 种类的微生物不仅对锰的敏感性不同，对不同程度 的锰污染敏感性也不同. 但是微生物群落遗传多样 性并不是简单的随着锰污染的加重而减少在 S3 样 点条带数目最多. 在较低浓度锰污染的样点S3 S6， DGGE 图谱条带数目虽然变化不大， 组成图谱 的条带位置却明显不同. 考虑到微生物种群之间诸 如偏利、协同、共生、偏害、竞争等复杂的关系， 可能是一定程度的锰污染改变了群落内部种群之间 的关系，某些对锰浓度敏感的细菌的消亡或者一些 耐锰细菌产生的抗性保护了其他种群的微生物[12]. 微生物群落对重金属的耐受性可能是因为后 天适应，基因变异，或者通过群落结构中种群组成 的改变而更具有耐受性[13]. 大多数生物控制对金属 的抗性的基因表现在质粒中，因此可以依此获得对 环境中重金属的耐受性. 重金属抗性的基本机理包 括酶解，细胞壁的吸附，细胞内特殊组分的吸附， 组织细胞对重金属的吸收和排除细胞质. 在本研究 中，锰污染土壤微生态环境与微生物多样性的内在 关系主要表现在作用与反作用，抑制与适应，稳定 与变异，诱导与重建的相互依存、相互影响、共同 演化，其结果使得适应锰胁迫环境的优势菌群得以 保留， 群落结构和多样性发生变化， 耐受性提高. 因 此，了解和调控锰污染土壤的微生态环境，实现微 生物群落演变，提高群落功能和耐受性，就成为土 壤功能有效恢复的重要途径. 以上关于微生物群落多样性的分析，基于一个 假设， 即 DGGE 图谱中的每一个单独条带代表一个 单独的菌种，条带的密度对应该菌种的丰度. 但是 由于 DNA 提取和 PCR 扩增某些未知种群在定量方 面的限制[14-16]，以及不同序列 DNA 存在共迁移的 可能性，这些假设存在一定的局限，并不完全正确. 所以该方法并不能完全揭示土壤微生物的生态特征. 但 DGGE 条带的位置和多少在一定程度上确实能 作为细菌群落结构和多样性的一个反映，DGGE 图 谱也提供了一个在分子水平量度微生物群落遗传多 样性变化的方法[17]，能补充传统培养技术研究微生 物方法的不足，对进一步了解研究微生物生态系统 有重要意义. 3 结论结论 湘潭锰矿尾渣坝附近水稻田土壤表现出来的 锰污染， 可能与锰冶炼过程中产生的大量含锰废气、 废水和冶炼渣，及其干湿沉降、污灌和重金属迁移 等有关[18,19]. 锰污染不仅会危害动物健康及植物生 长发育，也会影响土壤微生物生态特征. 通过利用 PCR-DGGE 方法，得出以下结论 1 锰污染改变了土壤微生物群落结构和遗传 多样性. 高锰浓度条件显著降低土壤中微生物种群 数目；中等锰污染主要是影响微生物群落的结构， 锰浓度的变化导致了某些细菌种群的消失，同时也 促成了某些耐受性细菌在特定的锰浓度范围下存 活. 2 土壤微生物对锰污染所做出的反应是基于 种群的群体性反应，锰污染对微生物群落结构和遗 传多样性的影响主要是通过影响群落中一部分对锰 浓度敏感的种群而实现的. 1 2 3 4 7 5 6 0.66 0.80 0.90 1.00 第 4 期 刘云国, 周海舟, 冯宝莹, 等 锰污染稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性研究 61 参考文献参考文献 [1] Valery B, Eugene K. Soil surface geochemical anomaly around the copper-nickel metallurgical smelter[J]. Water Air and Soil Pollution, 1998, 103 197-218. [2] McGrath S P, Zhao F J, Lombi E. Plant and rhizosphere processes involved in phytoremediation of metal-contamin- ated soils[J]. Plant Soil, 2001, 232 207-214. [3] Sandaa R A, Torsvik V, Enger O, et al. Analysis of bacterial communities in heavy metal-contaminated soils at different levels of resolution[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1999, 30 237-251. [4] Giller K E, Witter E, McGrath S P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils a review[J]. Soil Biology 2. Kunming University of Science and Technology, Kunming, Yunnan, 650093 Abstract Aiming at the new kind of metal material, low- carbon ductile iron, the technics of austempering has been researched. We measured different mechanical properties, analyzed the microstructure of low-carbon ductile iron at different austenitizing time, austempering temperature, austem- pering time. Experiment results indicates that when austenitiz- ing at 900 ℃ for 40min, austempering at 340 ℃ for 30 min, we can obtain a very nice mechanical property, σb1 040 Mpa, δ3, ak42 J/cm2, HRC32. Key words low-carbon ductile iron; austempering; austenite- bainite; technics 收稿日期收稿日期2007-10-18 作者简介作者简介 李玲芳1981-, 女, 助教, 硕士, 研究方向为材料 加工工程. 责任编校责任编校 刘刚毅 上接第上接第 57 页页 epichlorohydrin and triethylamine is 0.951, guarantee reaction system pH 7-8, stirring time about 16 hours, the temperature does not exceed 55 C. Key words 3-chloro-2-hydroxypropyl triethyl chloride; triethylamine; epichlorohydrin; ether agent; Synthesis of water 收稿日期收稿日期2007-10-15 作者简介作者简介杨建洲1964-, 男, 教授, 主要从事有机合成和 精细化学品研究. 责任编校责任编校 谭长贵 上接第上接第 61 页页 soil parameters had been detected, the observed changes in the different soil microbial populations are probably a combination of both direct and indirect effects of manganese contamination. Key words manganese; microbial community; diversity; 16S rDNA; DGGE 收稿日期收稿日期2007-09-20 基金项目基金项目湖南省自然科学基金资助项目04JJ3013；教育 部博士点基金02250532009 作者简介作者简介刘云国1955-, 男, 教授, 从事生态环境及重金 属污染研究. 责任编校责任编校谭长贵 上接第上接第 68 页页 materials science is the thermodynamics of solidification and nucleation. The derivation procedure of the ulae relating to consolidation and nucleation thermodynamics for liquid metals in some teaching materials was analyzed in this paper. It is found that there is dimensional heterogeneity of some parameters, resulting in the wrong results. By unifying the dimension of parameters, the corrective relationship of the critical diameter of crystal nucleus for homogeneous nucleation is obtained. And its validation is examined by practical example. The results show that the corrective relationship of the critical diameter of crystal nucleus for homogeneous nucleation is reliable. Key words Liquid metal; consolidation thermodynamics; nucleation thermodynamics 收稿日期收稿日期2007-09-29 基金项目基金项目国家自然科学基金50774034; 湖南省自然科学 基金06JJ20005; 湖南省教育厅科研项目06B038,05A055; 湖南省教育科学“十一五”规划课题XJK06CGD070; 湖南 理工学院教研教改项目2007B06 作者简介作者简介 蔡安辉1970-, 男, 副教授, 博士, 主要从事凝固 理论和金属材料等方面的研究. 责任编校责任编校 刘刚毅