中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂.pdf
第6 0 卷第3 期 20 08 年8 月 有 色金属 N o n f e l - r o u sM e t a l s V 0 1 .6 0 .N o .3 A u g u s t 20 08 中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂 周洪波,曾伟民,李莹,刘晰,邱冠周 中南大学资源加工与生物工程学院,长沙4 1 0 0 8 3 摘 要通过正交试验结果直观分析、因素指标分析和方差分析,研究真空冷冻干燥保藏法中保护剂的作用。结果表明,保 护剂的最佳组合类型为甘油1 2 %、蔗糖6 %、脱脂牛奶4 %、海藻糖1 0 %。保护剂种类对提高存活率的影响依次为甘油 海藻糖 脱脂牛奶 蔗糖。使用最佳保护剂组合可使冷冻干燥中度嗜热茵的存活率达到8 3 .7 %。 关键词冶金技术;中度嗜热菌;冷冻干燥保藏;保护剂;正变试验 中图分类号T F l l l .3 1 1文献标识码A文章编号1 0 0 1 一0 2 1 1 2 0 0 8 0 3 0 0 8 0 0 4 中度嗜热菌 M o d e r a t et h e r m o p h i l i em i c r o o r g a n . i s m s 作为一类特殊的微生物类群,在微生物浸出硫 化矿工艺中发挥着重要的作用。应用中度嗜热菌浸 出硫化矿相对中温菌具有反应快、浸出周期短、持续 浸出部分难溶硫化矿如黄铜矿等优点[ 卜3 | 。喜温 硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l u sc a l d u s 作为中度嗜热浸 矿菌的重要一员,在浸矿体系中为硫的代谢、矿物表 面钝化膜的消除、体系低p H 值的维持等发挥着重要 作用【4 j 。然而,该菌具有难纯化、难培养等特点,因 此,系统地开展中度嗜热菌的保藏研究,对促进该菌 的研究和在微生物冶金中的应用有非常积极作用。 目前国内外对中度嗜热菌多采用常规传代保藏 和冰箱低温保藏,容易产生变异失活,甚至死亡【5J 。 冷冻干燥作为当今微生物保藏的一种较好方法[ 6 】6 , 是否对嗜热茵同样有效,国内外尚未有相关的报道。 这主要是因为嗜热菌独特的生理结构和生长特性, 使得该类菌无法适应冷冻干燥中的各种苛刻条件。 特别是无法承受冷冻时巨大的冷冻压力。导致细胞 膜通透性的改变和代谢损伤【7 1 。因此,选择适宜的 冷冻温度,加入合适的保护剂减少细胞膜在冷冻干 燥中的损伤,是提高菌存活率的关键。 研究了在冷冻干燥前合适的预冻温度,然后以 甘油、蔗糖、脱脂牛奶、海藻糖为保护剂,采用正交试 验设计,优化组合,筛选出冷冻干燥保藏中度嗜热菌 J .1 菌的最佳保护剂组合,最后通过与常规冷冻方法 收稿日期2 0 0 6 0 8 3 1 基金项目国家自然基金刨新研究群体科学基金资助项目 5 0 3 2 1 4 0 2 ;国家重点基础研究项目 2 0 0 4 C B 6 1 9 2 0 4 作者简介周洪波 1 9 6 9 一 .男,湖南湘潭市人,教授,博士。主要从 事微生物及生物冶金等方面的研究。 比较验证该保护剂组合在冷冻干燥中的可行性,为 该类菌种保藏存活率的提高提供了新途径。 1实验方法 1 .1 试验材料 1 .1 .1 菌种。喜温硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l u s c a l d u s J .1 G e n b a n k 登陆号D Q 3 6 4 6 0 1 ,从江西德 兴铜矿某矿坑分离得到。 1 .1 .2 培养基。A N H 4 2 S 0 43 .0 9 ,N a 2 S 0 4 2 。l g ,M g S 0 4 .7 H 2 00 .5 9 ,,K 2 H P 0 40 .0 5 9 。K a 0 .1 9 ,c a N 0 3 20 .0 1 9 ,蒸馏水1 0 0 0 m L ,p H 值调至 2 .0 ,高压灭菌2 0 m i n 。B 单质硫粉高压灭菌 2 0 m i n 。将B 硫粉以1 .5 %的量加入到A 培养基中, 作为中度嗜热菌的培养基。 1 .1 .3 保护剂系统。预冻试验保护剂甘油5 %, 1 0 %,1 2 %。正交试验保护剂组合甘油 6 %,1 2 %, 1 8 % ,蔗糖 6 %,1 2 %,1 8 % ,脱脂奶粉 4 %,6 %, 8 % ,海藻糖 2 %,6 %,1 0 % 。 1 .2 试验过程 1 .2 .1 冷冻干燥制备活菌粉剂工艺流程。菌种活 化一液体扩大培养一菌种收集一 保护剂一 细菌悬 液一冷冻干燥一活菌粉。 1 .2 .2 菌种的培养和牧集。从新鲜的J .1 菌株固 体平板上挑取单菌落,接种于含3 0 0 m L 培养基的 5 0 0 m L 的锥形瓶中,于4 5 ℃,1 7 0 r /m i n 摇床振荡, 活化并扩大培养。培养3 d 后,细菌生长达到稳定 期,取样计数。同时等量分装于5 0 m L 的离心管中, 4 “ C ,1 0 0 0 0 r /m i n ,离心1 5 m i n 。弃上清,用等量的不 同种类的保护剂重新悬浮菌体,充分混匀,分装于自 制的冻干安培管中。 万方数据 第3 期 周洪波等中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂8 1 1 .2 .3 预冻试验。由于国内外应用冷冻干燥法保 藏高温菌的例子很少,而且高温茵的细胞壁很薄,不 宜承受较大的外界压力。所以采用一1 9 6 ℃,一 7 0 ℃,一2 0 ℃三种温度梯度对J 一1 菌进行预冻,以便 得出最佳预冻效果。取9 支冻干安培管,编号1 ~ 9 ,将菌悬液分别装入安培管中。1 ~3 号加入5 %的 甘油、4 - 6 号加入1 0 %的甘油、7 ~9 号加入1 5 %的 甘油作为保护剂。每3 支分别置于液氮 一1 9 6 ℃ 、 冷冻箱 一7 0 ℃ 、冰箱下层 一2 0 ℃ 预冻1 0 h 。 1 .2 .4 冷冻干燥。将预冻效果最好的菌样按常规 方法在真空冷冻干燥机中冷冻干燥1 5 h ,得到冻干 粉,安培封口,并于4 ℃保藏。 1 .2 .5 存活指标测定【8 】。采用U V .9 2 0 0 分光光度 计,在6 0 0 n m 处测量J 一1 菌的O D 值 相对细胞生 长量 ,具体操作根据预冻和冷冻干燥有两种。 1 取出预冻后的安培管,置于3 8 ℃水浴锅中 加热、溶解,充分摇匀,待活性恢复。从中分别取出 1 m L 接种于含2 0 m L 培养基的3 个5 0 m L 锥形瓶 中,取一瓶4 ℃下放置作为对照,其余2 瓶4 5 ℃, 1 7 0 r /m i n 下培养3 d 。测量生长菌和对照菌的O D 值,其O D 差值即为存活指标存活指标 O D 生长茁 一O D 对照茁 1 0 0 。 2 取冷冻干燥后的菌种安培 冻干粉 ,每管加 3 m L 的培养基,恢复活性和相对存活率的测定如 1 所述。 1 .2 .6 存活率测定。存活率的验证试验采用血球 计数板计数法测定活茵数。冷冻干燥前用于计数的 活菌为刚培养至稳定期的J - 1 菌,冷冻干燥后用于 计数的菌是冻干粉在3 8 ℃下恢复活性4 h ,再用培养 基稀释到5 0 m L 量之后的J .1 菌 不经过培养 。 2 试验结果与分析 2 .1 预冻试验结果 为了提高冷冻干燥的效果,选择最佳预冻温度 显得很重要。针对中度嗜热菌这一类特殊的微生 物,设计试验分析不同预冻温度对保藏效果的影响。 由于该菌在不加任何保护剂的情况下,冷冻干燥后 的存活率很低,所以加入5 %,1 0 %,1 5 %三种浓度 的甘油进行预冻试验。一1 9 6 ℃,一7 0 ℃,一2 0 ℃三 种温度和5 %,1 0 %,1 5 %三种甘油浓度对菌J 一1 预 冻后相对存活率如表1 所示。 由表1 看出,在温度一7 0 ℃、甘油浓度1 0 %时, J - 1 菌的存活率最高,为1 2 .7 。而其他组合。则相对 要低的多。所以采用该预冻组合,进行后续的冷冻 干燥试验。 表1 预冻温度和甘油浓度对相对存活率的影响 T a b l e1E f f e c to fp r e - f r e c z e nt e m p e r a t u r ea n d g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o nO ni n d e x 2 .2 保护剂组合类型对菌种存活率的影响 选择L n g 3 4 正交表,对甘油、蔗糖、脱脂牛奶、 海藻糖四种保护剂的组合开展冷冻干燥试验,将冷 冻干燥后菌的相对存活率取3 次试验的平均值,填 入到正交试验表的相应位置,对数据进行分析,如表 2 所示。 表2L n 9 3 4 正交表与试验结果 T a b l e2 岫 3 4 o r t h o g o n a le x p e r i m e n tt a b l e ‘ a n de x p e r i m e n t a Ir e s u l t s 2 .2 .1 直观分析。从表2 的结果中均值K 可以看 出,甘油1 2 % A 2 、蔗糖6 % 马 、脱脂牛奶4 % C 1 、海藻糖1 0 % I h 组合为A 2 8 1 C 1 D 3 为J 一1 菌 冷冻干燥的最佳保护剂组合。 2 .2 .2 因素指标分析。 1 甘油、蔗糖、脱脂牛奶、海藻糖4 种因素对菌 株J l 冷冻干燥后指标有不同影响,见图1 。由表2 和图1 可以看出,甘油为1 2 %时,J - 1 茵存活率要明 显高于甘油浓度为69 6 和1 8 %时,指标达到 1 6 .7 0 2 。蔗糖6 %,1 2 %和1 8 %三个水平中6 %更 合适。脱脂牛奶浓度为6 %时,菌存活率最低,4 % 时的指标相对8 %时要高。J .1 菌存活率随海藻糖 浓度的提高而提高,1 0 %时最佳。 2 极差R 反映各因素作用的大小。极差大的 意味着该因素对测定指标的影响大,反之影响小。 万方数据 有色金属 第6 0 卷 根据表2 中极差R 的大小,可以看出各因素的主次 关系为甘油 海藻糖 脱脂牛奶 蔗糖。 1 6 鋈t t 1 2 6 1 21 861 21 8 468 2 61 0 保护枘浓度,% 图1因素与指标关系 F i g .1R e l a t i o n s h i po ff a c t o r sa n di n d e x 2 .2 .3 方差分析。对表2 中各因素进行方差分析, 计算结果表明甘油、海藻糖对菌株j - 1 冷冻干燥存 活率有非常显著的影响,如表3 所示。F 01 0 F F 0 .0 5 时,对应因‘素为显著因素,记为* ,F F o .0 5 时,对应 因素为高度显著因素,记为* * 。 方差分析结果表明,甘油和海藻糖的F 值明显大 于临界值F 0 .1 0 ,说明甘油和海藻糖对菌株j - 1 冷冻干 燥存活率的影响高度显著。脱脂牛奶的F 值介于 F 0 .1 0 和F 0 .0 5 之间,说明脱脂牛奶对该菌冷冻干燥存活 率影响显著。蔗糖的F 值小于临界值F o .0 5 ,说明蔗 糖对该菌冷冻干燥存活率的影响不显著。 表3 冷冻保藏保护剂试验结果方差分析表 T a b l e3V a r i a n c ea n a l y s i so fe x p e r i m e n t a lr e s u l t so nc r y o p r o t e c t a n t su s e di nf r e e z e - d r yp r e s e r v a t i o n 2 .3 最优化组合结果的检验 采用正交法筛选出的保护剂的最优组合为 A 2 B lC l D 3 ,郎甘油1 2 % A 2 、蔗糖6 % B 1 、脱脂牛 奶4 %’ c 1 、海藻糖1 0 % D 3 。为验证该组合的可 行性,采用A 2 8 1c 1 D 3 保护剂组合与空白样和只加 1 0 %甘油作为保护剂的样品 传统的冷冻保藏中以 1 0 %甘油为保护剂 进行冷冻干燥,用血球计数板计 数法测定冷冻干燥前后活菌数,计算其存活率。结果 如表4 所示。 表4 三种试验条件下的存活率测定 T a b l e4 L i v a b i h t yd e t e r m i n a t i o nu n d e rt h r e e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s 从表4 可以看出,以A 2 B lC lD 3 组合的保护剂用 于J .1 菌的冷冻干燥,其存活率达8 3 .7 %,明显高于 以1 0 %甘油作为单一保护剂 3 7 .2 % 和不加任何 保护剂的空白实验 2 .1 % 的存活率。 3讨论 冷冻干燥可以从微生物细胞中除去大部分水 分,使细胞的生理活动降至最低水平,从而达到长期 保藏的目的。然而,在真空冷冻干燥过程中,冷冻和 干燥两个过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡 及某些酶蛋白分子的钝化旧J 。因此为了提高微生 物真空冷冻干燥后细胞的成活率及稳定性,常在冷 冻时加入各种保护剂来保护活细胞【1 0 1 。保护剂的 使用不仅能够通过使悬浮微生物冷冻时形成完全或 几乎完全玻璃化态,消除冰晶的机械应力和冰晶脱 水可能导致的膜相转变,达到保护的目的,而且干燥 时在水分子脱去后,能取代水分子的作用,维持生物 分子的结构和功能不受损伤[ 1 1 - 1 2 I 。冷冻干燥常用 的保护剂有甘油、脱脂乳、海藻糖、蔗糖等L l3 J ,但是 不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的。单 一的保护剂并不能满足冷冻干燥的要求,所以抗冻 保护剂一般是按~定比例混合使用【1 4 I 。 通过正交试验,得出中度嗜热菌J .1 菌冷冻干 燥的最佳保护剂组合为A 2 B ,C 1 D 3 甘油1 2 %、蔗糖 6 %、脱脂牛奶4 %、海藻糖l O % 。并通过验证试验, 中度嗜热菌j - 1 菌冷冻干燥后的存活率达8 3 .7 %,相 比单一保护剂 3 7 。2 % 和不加保护剂 2 。1 % 时的存 活率分别高出2 倍多和4 0 倍。这说明,应用该保护 剂组合进行中度嗜热菌的冷冻干燥是可行的,为保证 冷冻干燥后保藏效果提高了可能。 万方数据 第3 期周洪渡等中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂8 3 参考文献 [ 1 ] R i v e r a .S a n t i l l a nR ,B a l l e s t e rP e r e zE ,B l a z q u e zA .B i o l e a c h i n go fac o p p e rs u l p h i d ef l o t a t i o nc o n c e n t r a t eu s i n gm e s o p h i l i ca n d t h e r m o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m 【C ] //B i o h y d r o m e t a l l u r g ya n dt h eE n v i r o n m e n tT o w a r dt h eM i n i n go ft h e2 1 s tC e n t u r y .A m s t e r d a m E l s e v i e r ,1 9 9 9 1 4 9 1 5 8 . 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K e y w o r d s m e t a l l u r g i c a lt e c h n o l o g y ; m o r d e r a t e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a ; f r e e z e d r yp r e s e r v a t i o n ; c r y o p r o t e c t a n t s ;o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 万方数据