土壤和白菜中低分子量有机酸的气相色谱分析_谢文明.pdf

2009年4月 April 2009 彳i矿测 试 ROCK AND MINIERAL ANALYSIS \iol. 28 , No. 2 97 100 文章编号0254 - 5357 2009 02 - 0097 - 04 土壤和白菜中低分子量有机酸的气相色谱分析 谢文明 12 ，KO Kwang-yong ， LEE Kyu-seung （1 ．吉林农业大学 ，吉林长春 130118 2 ．忠南大学 ，大刚韩国 305 - 764） 摘要利用甲醇 一硫酸混合液（ 体积比10 7 ）对土壤和白菜中低分子量有机酸同时进行提取和甲酯化衍 生，然后利用二氯甲烷液 一 液萃取，气相色谱法分析。土壤 中7种低分子量有机 酸（ 草酸、丙二酸、反丁烯 二酸 、琥珀酸、马来酸、L-苹果酸、柠檬酸）的添加回收率为81. 9395. 58 ，白菜中的添加回收率为 84. 78106. 99 ，方法的检出限为0.724.14 mg/kg。方法用于测定根际、非根际土壤和白菜根系、茎 叶中的低分子量有机酸，结果准确可靠、， 关键词气相 色谱法；衍生化低分子量有机酸；土壤；白菜 中图分类号0657. 71 文献标识码A Determination of Low Molecular Weight Organic Acids in Soils and Cabbages by Gas Chromatography XIE en-ming 、工 , KO Kwang-yong2 , LEE Kyu-seung 1. Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Chungnam Nationai University, Daejeon 305 -764, Korea Abstract The low molecular weight organic acids LMWOAs in thizosphere soil, bulk soil, root and leave of cabbages were extracted and derived by the mixture of methanol and sulfuric acid 10 7. Seven organic acids oxalic, malonic, fumaric, succinic, maleic, L-malic and citric acid were identified and quantified by CC instrument equippecl with FID. The recovery were ranged from 81. 930/o t0 95.58u/o for soils and from 84. 780/o t0 106. 99 for roots. The detection limit was ranged from 0. 72 mg/kg t0 4. 14 mg/kg. The was suitable for the reliable and accurate determination oflow molecular weight organic acids in soils and cabbages. Key words gas chromatography ; derivatization; low molecular weight organic acid; cabbage; soil 低分子量有机酸是指相对分子质量 500的 含羧基化合物，是土壤中广泛存在的一类非常活泼 的物质。土壤环境中的低分子量有机酸主要来源 于表层土壤有机质分解、植物根系分泌物、微生物 代谢作用和施人土壤有机物的转化 【卜纠 。低分子 量有机酸是根系分泌物中最为重要的成分，有些是 三羧酸循环的中间产物，如柠檬酸、琥珀酸和苹果 酸等；也有其他一些常见的脂肪酸（如甲酸、乙酸、 丙酸、酪酸、草酸、乙醇酸、乳酸和酒石酸）和芳香 酸 【4 。（ 见图1）。 H。。 酒石酸 HOOC/\/\COOH HCOOH 。 。鼠 反丁烯二酸 HOOCiCOOH 琥珀酸 L-苹果酸 HOOC HOO, 督咖 H 柠檬酸 图l 常见的低分} 量有机酸化学结构 Fig.l Chemical structures of low molecular weight organic acids 收稿日期2008 -07-25；修订日期2008-11-21 基金项目韩国忠南大学基金项曰资助 2006；吉林农业大学博士科研启动基金项目资助2005 作者简介谢文明（1970 - ），男，山东潍坊人，博士，副教授，主要从事土壤中农药等有机污染物的环境行为以及 T亏染消除研究。E-mail xiewenming holmail．com 。 ， - 97 - 1 泌 鞴 ChaoXing 第2期 岩矿测 试 http∥www. ykcs.a.,【 .11 通过有机残体分解产牛的有机酸，有一部分是 原来植物体内游离的低级C，C。脂肪酸、草酸、 柠檬酸、苹果酸、酚酸等，但大部分是植物残体多种 成分发酵或水解产 ， Ji 的低级饱和脂肪酸、小质素转 化产生的酚酸、脂肪类分解产生的长链脂肪酸[5j 。 上壤低分子量有机酸的类型和数最闲土壤类 型、营养状况、上壤微生物的数量和活性而有很大 的变化，并且处于合成和分解的动态过程中，其浓 度一般不高 ㈠ J 。每千克土壤 中脂肪族一元羧酸 （甲酸、乙酸和丙酸等）的含量通常在0l mmol ， 而 二元 和三 元羧酸（包括草酸、柠檬酸、内二酸 、屿 来酸、琥珀酸和酒石酸 ）的浓度 通常在 050 pdmol。植物根际由于根系分泌大量的有机酸以及 分泌质子引起产酸细菌的繁殖生长，其低分子量有 机酸在每千克土壤中含量一般町高达1 10 mmol ， 明显高F本体土壤 。 6。7一 。 分离、纯化和测定土壤和根系中的低分子量有 机酸是研究低分子量有机酸在上壤巾的分布和作 用的基础。色谱法是目前分析低分子量有机酸最 普遍 的方法，主要 包括气相色 谱法和液相 色谱 法 卜陀1 。高效液相色谱法 HPLC是较为常用的 测定方法，但由于低分子量有机酸通常具有较低的 pKa值，需要在较低pH的流动相中进行色谱分 离，所以对色谱柱的要求较高。另外对于多种低分 子量有机酸的分析，HPI ．C方法很难达到满意的分 离度 ”1 。而将低分子镀有机酸甲酯化衍生后利月 j 气卡 H色潜法测定有机酸，特别足利用毛细管柱分 离，可以达到满意的分离度 11 -14 J 。 本实验的目的足发展一种能够准确、快速检测 土壤和植物巾低分子最有机酸的方法。 1 实验部分 1.1 仪器和主要试剂 Agilent 6890N气相色谱仪（美国Agilent公司， 配备FID检测器）。 Alllech ArrWAX 弹性石英毛细管柱10 mX 0. 53 mm1.2 yum。进样I 『和火焰离子化检测器 的温度分别为250cC和250 ℃ 。柱箱程序升温初始 温度为80℃，保持2 min，然后以10℃/min的速率 升温至200 ℃ ，保持5 min。 载气为高纯氮气，色谱 柱流速为7.1 rnL/min ，尾吹和载气采用恒定流量 45 mL/rnin的模式，利用自动进样器在不分流模 式下进样1lcL，分流时问0.5 min。 各种低分子齄 - 98 - 有机酸在混合标样中的浓度根据在实际样品中的 大致浓度进行调整。 硫酸、甲醇、二氯甲烷等试剂均为分析纯． ， 1.2 植物和土壤样品的采集和处理 把盆栽的白菜从靠近土表的部位切断，将根和 茎叶部分分丌。把 白菜的茎叶小心切碎并收集。 将白菜的根系从土壤中挖出，轻轻地抖落附着的大 土块，将牢固附着在根系上的土壤用软刷子刷下来 作为根际土壤，剩余十壤充分混合作为非根际 土 壤。植物的根、茎叶、根际土壤和非根际上壤样品 均在50 ℃条件卜 ．]燥48 h， 然后磨碎，过筛 0.5 fjlfll 。在 - 24cC条件下储存 ，备J{j。 ． 1.3 低分子量有机酸的提取、甲酯化和净化 称取 1 9土壤样于20 ml。具塞刻度试管中， 加入9 mL甲醇 一 硫酸溶液（体积比10 7 ）。在 60。 C水浴巾提取和【 『 1酯化 l2 h， 冷却后将提取液 离心分离七清液，然后 再加入5 mI。qJ醇涡旋混合 后离心，将上清液转移。合并两f二清液并转移奄 60 rnI．分液漏 斗巾，加入l InI．饱和NaCl 溶液、 20 mL蒸馏水 、5mL 氯甲烷，剧烈振荡60 s后静 置分层。将二氯Lfj烷转移至10 rnL试管中，剩余水 相加入另外3 mL二氯甲烷萃取，合并两次的二氯 甲烷相。将脱水后的氯甲烷卡 H在40℃水浴条件 l-利』 H氮气吹干，然后准确加入1mL二氯甲烷涡 旋混合后进行气相色谱分析。 植物样晶的称样量为0.5 9，其他处理步骤I J 十壤样品。 2 结果与讨论 2.1 低分于量有机酸的定性和定最 利用1.1节的色谱条件对不同浓度的标样进行 分析，确定各低分子量有机酸的相对保留时问、线性 范围和线性相关系数，结果显示，在分析浓度范围内 各低分子毓有机酸衍牛物的线性关系良好 （ 见 表1）。， 色谱流m曲线图表明，采用1.1节色谱条件IIr 以在较短的时问J 人 J使所分析的低分子量有机酸达 到完全分离，其中7种低分子量有机酸在色谱柱中 的洗脱时问小超过16 min ，每个样品的分析周期为 20 min。 标样衍，卜化后均可以达到完全基线分离， 而l L没有杂质 二r扰 ，从而确保迅速和准确地对土壤 和植物 中有机酸进行分析。图2分别为标样、上 壤、根系和叶中的低分子量有机酸甲酯化衍生物的 色谱图。 ChaoXing 第2期 谢文明等上壤和白菜-}1低分子量有机酸的气相色谱分析 第28卷 犬1 低分子量仃机酸的卡 H对保留时问、线性办程Ti11,fli父系数 Talle lRelative retenticm time. linear equations alid c-“rrelati“n.’efTicientsf low rnolerular weight organic acids ┏━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━┓ ┃ 低分子馈 ┃ 相对保留时间 ┃ 平均相对保留时问 ┃ ┃ ┃ 榆出限 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 线 ‘阵方程 ┃ 相关系数 ┃ ┃ ┃ 有机酸 ┃ tli/min ┃ LR/min ┃ ┃ ┃ Lu/ mg ． kg_| ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ 单酸 ┃ 4. 287 , 4. 287, 4. 286 , 4. 288 . 4. 288 . 4. 287 ┃ 4. 287 ┃ y3.65x28.40 ┃ O．9997 ┃ 1. 42 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ I坷酸 ┃ 5. 648 , 5. 650, 5. 647 , 5. 650. 5. 648 , 5. 649 ┃ 5. 649 ┃ y 0. 70 x - 13. 99 ┃ 0. 9999 ┃ 2. 44 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ 反J ‘烯 二酸 ┃ 6. 095 , 6. 098 , 6. 095 , 6. 096. 6. 096, 6. 097 ┃ 6. 096 ┃ y 0. 36x 5. 24 ┃ ．9999 ┃ 2. 84 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ 琥珀酸 ┃ 6. 712 . 6. 715 , 6. 713 , 6. 713 . 6. 713 , 6. 713 ┃ 6. 713 ┃ y 9. 66x - 23. 71 ┃ 0. 9997 ┃ 3. 72 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ 马来酸 ┃ 7. 782. 7. 783 , 7. 783 , 7. 783 , 7. 783 , 7. 782 ┃ 7. 783 ┃ y 8. 94x - 11. 99 ┃ 0. 9999 ┃ 3. 15 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ 1．一节果酸 ┃ 1I . 432 . I I . 43ii; , 11. 432 , i1. 433 , I I . 433 , 11. 433 ┃ 11. 433 ┃ y 21. 34x - 64. 17 ┃ 0. 9998 ┃ 0. 72 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━┫ ┃ 柠檬酸 ┃ 15. 418 . 15. 417 , 15. 416 , 15.417, 15. 416. 15. 415 ┃ 15 417 ┃ y 9. 77x - 254. 14 ┃ ．993 2 ┃ 4. 14 ┃ ┗━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━┛ t.lmin 40 20 II 60 20 图2低分 产蕞仃机酸色潜网 Fig.2Chromatograms Ilf.low molec-ular weigl]t organic acids 分别取一定浓度的草酸、 丙二 酸、J ‘二酸 、反丁 烯_二酸、顺丁烯二酸、节果酸j柠檬酸标样，按样品 处理方法进行甲酯化，在上述最佳色谱条件l-进样 分析，得到标样色谱图，确定各有机酸的出峰顺序 和所刈 ‘应的保留时问 。在相同色谱条件下，将样品 色谱图与有机酸标准样品色谱图进行对照，根据保 留时间进行定性分析；根据峰面积利用外标法进行 定嚣分析。 2.2 加标IIJI收试验 为明确低分子量有机酸在样品提取、甲酯化和 液 一 液分配净化过程中的损失，在样品基质中添加 一定量的低分子量有机酸 ，在准确测定样品本底后 计算加标回收率。表2结果表明，所分析的低分子 量有机酸的回收率均在 80以I，显示该方法可 以准确和精确地测定土壤和植物样品中的低分子 量有机酸。 表2 I壤和rI菜楸系中低分子最仃机酸的加标ILII收牢 ‘” Table 2 Recov{-,riesf low molalular weight orgaliicacjJs from soils and roolh 样l ILl 低分了量 有机酸 基质中含量 Pu/ mg ． kg “ 加标l脚收试验 pR ／mg ． kg 。1 测定值 平均值 添加最 添加后测定值 测定平均值 叫收率 R/ol。 土壤 草酸 丙■酸 反丁烯二酸 琥珀酸 马来酸 I。一苹果酸 柠檬酸 30.04. 28.49, 31.45 29.99 68.87, 65.31, 63.56 69.91 6. 09 , 5. 77 , 7. 63 5. 33 ,5. 05 ,5.42 42. 45 . 40. 25 .41. 53 6. 5 5.23 41.4 381. 22 2 549. 72 5 373. 84 203. 13 218. 04 74. 01 360. 31 352. 36 , 328. 99 . 345. 68 2239.02, 2248.8, 2250.33 5127.59, 4606.9, 4896.36 204.49, 195.81, 201.69 202. 07 , 179. 68 , 200. 37 69. 31 , 69. 24 , 70. 42 364. 71. 328. 62 . 342. 59 342. 34 2 246. 05 4 876. 95 200. 66 194. 04 69. 65 345. 31 81. 93 85. 35 90. 75 95. 58 88. 99 87. 04 84. 34 草酸 6.51, 3.65, 5.86 5.34 450. 26 488. 88. 498. 173, 474. 22 487. 09 106. 99 rxi-酸 475. 55, 529. 58, 540. 87 515. 34 5400. 72 4745.94, 5988.79, 5719.74 5484. 83 92. 01 反丁烯二酸 82. 06，45. 42，66. 53 64. 67 60730. 84 66887.51. 74 835. 8，49 930. 96 63 884. 75 105. 08 根系 琥珀酸 751. 18，731. 60，597. 21 693. 34 20 300. 13 21 363. 91, 25 583. 89，18 659. 68 21 869. 16 104. 31 马来酸 191.90, 213.54, 202.36 202. 60 41 800. 04 41719. 98. 50 611. 95, 33 296. 59 41 876. 17 99. 69 L -苹果酸 267.05, 253.21, 175.97 232. 08 884. 01 1121. 46,1230.21.847. 24 1 066. 31 94. 36 柠檬酸 1878. 57,1 639.51,1 124.7I l 547. 59 1 414. 31 2841.94, 3147.57, 2250.53 2746 68 84.78 ① “ 一 ” 表示浓度低于检H1l ； 艮。 - 99 - ChaoXing 第2期 岩矿测试 http∥www. ykc.s. ac..cT1 2.3 土壤和植物样品中的低分子量有机酸 在根际土壤和非根际土壤中均可以检测出丙 二酸和柠檬酸，而苹果酸只是在根际土壤中检m ， 在非根际土壤中未检出。丙二酸在根际土壤和非 根际土壤中的浓度差异并不明显；但是柠檬酸在根 际土壤中的浓度明显高于非根际土壤。在白菜的 根系和茎叶中可以检测出7种低分子量有机酸，而 且苇叶中的浓度明显高于根系中的浓度。在根系 中低分子 鲼有机酸 的浓度从 高到低的顺序 为 反丁烯二酸、丙二酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、草酸 和马来酸；而在茎叶中低分子量有机酸的浓度从高 到低的顺序为反丁烯二酸、柠檬酸、苹果酸、 丙二 酸、琥珀酸、马来酸和草酸（ 见表3）。 表3 白菜根系、茎叶、根际土壤和非根际土壤中低分子量有机酸浓度 1l rratie 3 Concentration of low molecular weight organic acids in cabbage leaves, cabbage roots, thizosphere soil and bulk soil ┏━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┓ ┃ ┃ ┃ ┃ 低分子量有机酸含量Pn/mg ． kg- ┃ ┃ ┃ ┃ 样品 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃ 草酸 ┃ 丙二酸 ┃ 反I ‘烯二酸 琥珀酸 t 5 来酸 ┃ 苹果酸 ┃ 柠檬酸 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━┫ ┃ 白菜根系 ┃ 223. 72 19. 74 ┃ 2 776. 13 273. 88 ┃ 4 765. 07 700. 99 400. 35 40. 56 50. 44 3. 38 ┃ 1127. 93 166. 27 ┃ 2710. 33 206. 66 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━┫ ┃ 白菜茎叶 ┃ 308. 59 77. 78 ┃ 5512.89 297.40 ┃ 30 202. 23 1 681. 74 2 820. 39 138. 99 403. 52 152. 68 ┃ 6022. 5 1268. 89 ┃ 11 371. 59 559. 35 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━┫ ┃ 非根际土壤 ┃ ┃ 6. 410.05 ┃ ┃ ┃ 253. 89 34. 70 ┃ ┣━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━┫ ┃ 根际土壤 ┃ ┃ 6. 930 55 ┃ ┃ 29. 944.16 ┃ 235.55 3.22 ┃ ┗━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┛ ①测定结果为平均值标准偏差n3 。 “ 一 ” 表示低丁检出限i、 3 结语 采用 甲醇 一 硫酸浸提有机酸并直接进行甲酯 化，游离有机酸可直接浸提甲酯化，结合态有机酸 亦可在酸的作用下完成酯交换，使游离及结合态有 机酸得以同时测定 [isj 。将提取和衍生同时完成， 不但可以减少样品前处理的步骤，而且能有效地避 免传统测定方法中浓缩和酯化过程中易挥发有机 酸的损失，酯化完全，样品转移简便，易于操作。 利用毛细管气相色谱法进行检测，选择性好， 分离度高，可以有效地避免植物根系分泌物样品巾 低分子量复杂介质的干扰，是一种对土壤和植物样 品中有机酸进行定性、定量分析的可靠方法。本方 法的建立为植物根系分泌物中痕量有机酸的研究， 以及植物根际环境中有机酸作用机理的探寻提供 了重要的实验手段。 4 参考文献 [1] Jones D L.Organic acids in Lhe thizosphere-A crilicaJ review[J].Plarzt Soil,1998 ,20525 - 44. 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