石油脱硫菌的筛选与培养基优化.pdf

第 3 3 卷第6 期 2 0 1 4 ． 0 6 行业论坛 石油脱硫菌的筛选与培养基优化 张虹 汪洋 袁红梅 尤凤丽 黄永红 大 庆师 范 学院 摘要生物脱硫 B D S 技术具有选择性高、反应条件温和、设备投资和操作费用低等优 点，是实现燃料油深度脱硫最有效的技术之一。实验分离得到6 株可降解D B T的脱硫菌，经比 较确定 了B 5为高效脱硫菌株 ，需进一步进行 菌种鉴定。对 B 5 菌株 的脱硫条件进行优化，确定脱 硫最佳培养基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接种量为8 ％，最佳D B T的含量为2 0 m g ／ L ．最 佳 p H值 1 0 、温度 3 0。 C，最佳菌龄 3 天，装液量在最少的时候脱硫效果最好 ． 关键词脱硫菌 ；菌株；培养基 ；优化 ；接种量 ；脱硫效果 d o i 1 0 ． 3 9 6 9 ． i s s n ． 1 0 0 6 6 8 9 6 ． 2 0 1 4 ． 6 ． 0 0 3 传统的物理和化学脱硫方法 H D S 存在着脱 硫不完全、成本高和操作费用高等缺点 。相比之 下生物脱硫 B D S 技术具有选择性高 、反应条件 温和、设备投资和操作费用低等优点，是实现燃料 油深度脱硫最有效的技术之一 。在脱硫微生物筛 选过程 中，D B T是公认 的脱有机硫模式化合物 ，据 此分离 来的菌种可有效 脱出有 机硫 ，且不破坏 C C 结构， 从而保留了燃料的热值 1 材料与方法 1 ． 1 实验材料 样本材料取 自大庆炼化公司聚合物二厂未被排 除 的工业 废水 。实验 器材 包 括压 力蒸 汽 灭菌锅 T O MY E S 一3 1 5 ，7 2 1 型 紫外分 光光度计 ，振荡 培 养 箱 H Z Q F 1 6 0 ， 超 净 T 作 台 V S 一 1 3 L U ，离心机 A l l e g r a 6 4 R 。 1 ． 2 实验方法 1 ． 2 ． 1 菌种 的 富集与 分 离 取 1 0 m L水 样 加 到 9 0 mL的 N B培 养 基 中 ， 3 0。 C，2 0 0 r ／ mi n 培养 3 d 后 ，从 中取 2 ． 5 mI 的上清 液加 到5 0 mL B S M培养基 的三角瓶 中， 相同培养 条件培养后，将菌液制备成梯度稀释液 1 0、1 0、 1 0 、l 0 ～ 、1 0 ～ 、1 0 倍 ，逐一标记 ，分别取0 ． 1 m L 稀释液加到 B S M固体平板上 ， 2 8 ～ 3 O。 C 恒温培养 2 3 d 至菌落出现。 挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进 行分离纯化 ，直到得到单菌株 的纯培养物 ，纯化菌 株保存于L B 斜面培养基上，4。 C 冰箱保存。 1 ． 2 ． 2菌株 降解效果的测定 挑取单菌落接入装有 5 m L N B培养液的试管 内 ，3 0。 C，1 5 0 r ／ rai n 摇床 培养 2 4 h 作 为种子液 。 取 l mL 种子液接人装有5 0 mI B S M 培养基的2 5 0 mI 1二角 瓶 中 ，3 0。 C，2 5 0 r ／ rai n摇 床 培养 7 2 h ，用 1 0 ％的 N a 。 C 0 ． 溶 液将 菌 种发 酵 液调 p H值 为 8 ． 0 ， 5 0 0 0 r ／ mi n 离心 1 0 mi n 除菌体 ，取 清4 m I ，加入 G i b b ’S 试剂4 0 L ，混匀，3 0。 C 反应3 0 m i n 后 ，测 其在 6 1 0 n K l 处吸光 度 ，代入 L 口 J 归方 程测 ⋯ 2 l 1 R P 含量。 1 ． 2 ． 3 脱硫菌脱硫条件的优化 1 培养基的优化。以B S M培养荜为基础培 养基 ，分别取 5 g ／ L葡萄糖 、2 ． 5 g ／ I 蔗糖 、6 mL ／ L 乙醇 、8 m L ／ L 甘 油 、4 L乙酸钠和 1 ． 2 g ／ l | 柠檬酸 钠作为碳源，7 2 h 培养后用紫外分光光度计测定J f 计算 2 一H B P含量 ，确定最适宜的碳源。以最任碳 源 作 为 B S M碳 源 ，分 别 取 2 ． 5 g ／ [ NH C I 、2 g ／ 1 N H O 5 g ／ L K N O 1 0 g ／ L 牛 肉膏和 2 5 L蛋 胨 作为氮源，7 2 h 培养后测定菌体产牛 2 一I I n I ] 城， 确定最适宜的氮源。 2 培养条件的优化 。培养 选取最任碳源和 氮 源 ，以 D B T为 唯一硫 源 ，以 2 ％ 、4 ％ 、6 ％ 、 8 ％ 、1 0 ％的接种量培养 7 2 h 。通过测定 菌体产 生 的2 一H B P 量确定最佳接种量 。在最佳碳源 、氮源 和接 种量的培养基 中添加浓度为 2 0 、4 0 、6 、8 0 和 1 0 0 mg ／ L的D B T ，培养 7 2 h 确 定最佳 的 D B T浓 度 。最 佳培养 基 中设 置 6 、7 、8 、9 、1 0 I州p t t 值 ，培养7 2 h 确定最佳 的p H值 。设 置2 0 、2 5 、 3 0 、3 5 、4 0。 C不 同温度 ，培 养 7 2 h 确 定最 佳 温 度 。选 取 冰箱 保存 的菌株 活化 培养 2 、3 、4 、5 天，将不同菌龄的菌分别接种于最佳培养基，培养 7 2 h 确定最佳菌龄。设置不同装液量，即每个2 5 0 m L 基金论文黑龙江省教育厅 自然基金项 目 “ 大庆油田石油脱硫微生物激励研 究” 1 1 5 2 3 0 0 1 。 一 6一 油气田地面工程 h t t p ／ ／ ， 、 v w． yqt dmgc ． c or n