黄铜矿表面生物吸附量的测定条件.pdf

收稿日期 2009- 12- 01 基金项目 国家自然科学基金资助项目 50674029, 50874030 ; 国家高技术研究发展计划项目 2006AA06Z127 ; 教育部高等学校 博士学科点专项科研基金资助项目 20060145015 ; 国家科技支撑计划项目 2008BAB34B01 作者简介 潘颢丹 1983- , 女, 辽宁沈阳人, 东北大学博士研究生; 杨洪英 1960- , 女, 河北张家口人, 东北大学教授, 博士生导 师 第31卷第7期 2010 年 7 月 东北大学 学报自然科学版 Journal of Northeastern University Natural Science Vol31, No. 7 Jul.2 01 0 黄铜矿表面生物吸附量的测定条件 潘颢丹, 杨洪英, 陈世栋 东北大学 材料与冶金学院, 辽宁 沈阳 110004 摘 要 采用茚三酮比色法测定了在细菌浸矿的过程中, 黄铜矿矿物表面吸附细菌细胞裂解液的吸光 度, 通过对测量波长、 裂解时间、 溶液 pH 值、 加热时间、 冷却时间等影响吸光度因素的实验研究, 得出了黄铜 矿表面细菌细胞裂解液吸光度的最佳测定条件为 波长 560 nm, 裂解时间 25 min, 溶液 pH 值 7. 0, 加热时间 15 min, 冷却时间 6 min在最佳条件下绘制出了吸光度与矿物表面细菌吸附量之间关系的标准曲线研究表 明细菌裂解液的吸光值与细菌的浓度成正比 关 键 词 生物吸附; 茚三酮比色法; 黄铜矿; 细菌; 矿物表面 中图分类号 TF 111. 3 文献标志码 A 文章编号 1005 -30262010 07 -0999 -04 Conditions for Biosorption Measuring on Chalcopyrite Surface PAN Hao -dan,YANG Hong -ying, CHEN Shi-dong School of Materials ninhydrin colorimetry; chalcopyrite; bacteria; mineral surface 关于嗜酸细菌吸附至矿物表面是当前的一个 研究热点[ 1- 6]在浸出过程中细菌吸附到矿物表 面是一个最重要的过程[ 4- 5,7], 也是矿物 尤其是 黄铜矿 生物浸出直接作用的前提在细菌浸出黄 铜矿的过程中, 吸附在矿物表面的细菌与矿物之间 的结合非常紧密研究表明, 用超声波甚至高速离 心等方法都很难将吸附在矿物表面的细菌全部脱 附,而荧光显微镜、 荧光抗体和 ELISA 等方法对 吸附细菌计数, 在具体操作中 都有一定的难 度[8- 9] 目前, 茚三酮比色法在测定矿物表面吸附细 菌蛋白质含量方面已有所研究[11]黄铜矿是铜矿 石中常见矿物, 特别是我国铜矿石以黄铜矿为主, 黄铜矿又是属于难于浸出硫化物, 所以本研究以 黄铜矿为研究对象, 采用茚三酮比色法, 确定黄铜 矿表面生物吸附的最佳测定条件, 计算吸附在黄 铜矿矿物表面的细菌数量, 从而探讨微生物对黄 铜矿难浸的原因 1 试验原理 当前茚三酮被广泛用于检测氨、 一级和二级 胺, 尤其是氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反 应产生黄色化合物, 所有的氨基酸及具有游离 - 氨基的肽与茚三酮反应都会产生蓝紫色化合 物这种蓝紫色化合物在一定波长下有一个最大 的吸收峰, 其颜色与该物质的含量成正比因此, 在其最大吸收波长处测定其吸光度, 则可以计算 出溶液中氨基酸和蛋白质的含量[ 10]蛋白质是细 菌的重要组成部分[ 11], 而氨基酸又是蛋白质的基 本组成单位, 所以可以采用茚三酮比色法测定吸 光度, 再通过拟合曲线计算出黄铜矿表面所吸附 的细菌数量 2 材料与方法 2. 1 试验原料 本试验所采用的浸矿细菌是一种混合菌混 合菌的优点在于它既具有氧化硫的能力, 也具备 氧化亚铁的能力该混合菌种以氧化亚铁硫杆菌 为主, 同时兼有氧化亚铁钩端螺旋菌和氧化硫硫 杆菌本试验采用的是液体 9 K 培养基[ 11], 用于 培养混合菌 采用的矿样来自某黄铜矿尾矿, 首先对矿样 进行了化学成分分析 表 1 和粒度分析 表 2 表 1 矿样化学成分分析 质量分数 Table 1 Chemical composition of mineral sample 试验矿样CuFeSZnMoNi 某黄铜矿尾矿0. 1110. 266. 40. 38 表 2 矿样粒度分布 Table 2 Granularity distribution of mineral sample 粒 级 0. 074 mm0. 044 mm 0. 074 mm0. 037 mm 0. 044mm 0. 037mm 质量分数/29. 5514. 193. 153. 16 采用 LEICA -MZ95 体视显微镜对矿样进行 了物相分析, 分析表明 矿样中有黄铜矿和石英、 斜长石等硅酸盐类物质, 其中黄铜矿是主要的硫 化物 图 1 , 在样品中对细菌起主要吸附作用 图 1 样品中的黄铜矿Cp Fig.1 Chalcopyrite Cpin sample 2. 2 茚三酮显色剂的配制 称取 05g 茚三酮和 03 g 果糖, 用蒸馏水溶 解并定容至 100 mL, 贮存于棕色瓶中, 低温保存 2. 3 细菌裂解液的配备 在500 mL 锥形瓶中, 将体积分数为 10 的 细菌液接种到 200 mL 的 9K 培养基中, 在温度为 44 , 转速为 190 r/ min 的恒温振荡箱中培养当 菌种活化完成后 电位达到 630 mV 以上 , 将质 量分数为 5 的矿样加入摇瓶中振荡培养 取 5 支 5mL 离心管, 分别注入 4 mL 上述加 矿菌液, 在离心机中以 2 000 r/ min 的转速离心 5min吸走上清液, 去除培养基液, 并用 pH 2 硫 酸溶液 4 mL 洗涤残留在矿物表面的非细菌物 质, 再次置于 2 000 r/ min 的离心机中离心 5 min 吸走上清液, 管内仅剩余表面附有细菌的固体矿 物分别注入 4 mL 0. 5 mol/ L 的 NaOH 溶液, 混 合均匀后, 置于 100 水浴中分别加热裂解 15, 20, 25, 30 和 35 min分别移取 2 mL 上清液于玻 璃试管中, 冷却后用 05 mol/ L 的盐酸将溶液中 和至 pH 7, 这时制备的溶液称为细菌裂解液 3 结果与分析 3. 1 最佳测量波长 在上述 5 支试管中分别加入 1 mL 茚三酮显 色剂, 混合摇匀, 试管口用薄膜封住, 防止水分挥 发将 5 支试管再次移入 100 水浴中加热 15 min, 冷却 10 min 后移入比色皿中使用 Optizen 2120UV 可见紫外分光光度计在吸光值为 520 600 nm 的波长范围进行扫描, 确定最佳波长 图 2扫描前用空白样进行校准调零空白样成分与 试验试样成分区别在于, 前者溶液中不含附有细 菌的固体矿物 图 2 反应产物在波长 范围为 520 600nm 时的扫描图谱 Fig.2 Scanning spectrum of reaction products in the wavelength range 520 600 nm 1000东北大学学报 自然科学版 第 31 卷 从图 2 中可以确定在波长为 560 nm 处出现 波峰, 表明此时吸光度最大, 为 0584故波长 560 nm 为试验最佳测量波长 3. 2 最佳裂解时间 最佳波长确定后, 重新设置可见紫外分光光 度计参数, 设定扫描波长为 560 nm针对上述 5 支经过不同裂解时间之后的显色液分别测定它们 在最佳波长时的吸光度值 A 图 3 图 3 不同裂解时间时反应产物的吸光度 Fig.3 Absorbence of reaction products for different cracking time 从图 3 可以看出, 当裂解时间少于 25 min 时, 裂解液反应产物的吸光度比 25 min 时的低, 说明吸附在矿物表面的细菌还未被完全裂解; 当 裂解时间多于 25 min 后, 裂解液反应产物的吸光 度变化不大, 基本维持在 044 左右, 说明此裂解 时间条件下吸附在矿物表面的细菌被完全裂解 因此, 25 min 为该试验最佳的裂解时间 3. 3 不同 pH值对反应产物吸光度的影响 先按上述方法制备细菌裂解液, 裂解时间为 25 min取 5 支灭菌试管, 各注入 2 mL 裂解液, 用 05 mol/ L 的 NaOH 溶液和 05 mol/ L 的盐酸溶 液调整各试管裂解液的 pH 值, 分别调至 50, 60, 70, 80 和 90然后各加入 1 mL 茚三酮显 色剂, 摇匀混合试管口用薄膜封住, 防止水分蒸 发将 5 支试管移入 100 水浴中加热 15 min, 冷 却 10 min 后移入比色皿中用紫外可见分光光度 计在波长为 560 nm 时测定不同 pH 值条件下各 反应产物的吸光度值 图 4 图 4 不同 pH值对反应产物吸光度的影响 Fig.4 Effect of pH value on absorbance of reaction products 从图 4 可以看出, 不同 pH 值对应着不同的 吸光度, 且 pH 7. 0 时反应产物的吸光度最大, 为 0728因此 pH 7. 0 为该试验最佳 pH 条件 3. 4 不同加热时间对反应产物吸光度的影响 按上述方法分别将 5 支试管移入 100 水浴 中分别加热 10, 15, 20, 25 和 30 min, 冷却 10 min 后移入比色皿中利用紫外可见分光光度计在波 长为 560 nm 时测定不同加热时间条件下各反应 产物的吸光度值 图 5 图 5 不同加热时间对反应产物吸光度的影响 Fig. 5 Effect of heating time on absorbance of reaction products 从图 5 可以看出, 不同的加热时间对应着反 应产物不同的吸光度, 且当加热时间为 15 min 时 吸光度最大, 为 0576加热时间大于 15 min 后, 反应产物吸光度变化不大说明在沸水中加热 15 min可使蛋白质、 多肽和氨基酸与茚三酮显色 剂充分发生反应因此, 15min 为该试验最佳加热 时间 3. 5 不同冷却时间对反应产物吸光度的影响 按上述方法将 5 支试管移入 100 水浴中加 热 15 min 后, 分别冷却 3, 6, 9, 12 和 15 min 后移 入比色皿中利用紫外可见分光光度计在波长为 560 nm 时测定不同冷却时间条件下各反应产物 的吸光度值 图 6 图 6 不同冷却时间对反应产物吸光度的影响 Fig.6 Effect of cooling time on absorbance of reaction products 从图 6 可以看出, 冷却时间在 6 min 以前, 吸 光度是随着冷却时间的增加而增大, 当冷却时间 为 6 min 时, 吸光度出现最大值 0401, 之后的时 间内, 吸光度值基本保持不变这表明最佳冷却时 间应控制为6 min, 同时也表明反应产物在短时间 1001第 7 期 潘颢丹等黄铜矿表面生物吸附量的测定条件 内能保持稳定 3. 6 矿物表面细菌吸附量标准曲线的绘制 取7 支灭菌离心管, 分别取浓度为 1092 108cells/ mL 的菌液 1, 2, 3, 4, 5, 6和 7 mL, 前6 个 管分别用蒸馏水补至 7mL在离心机中以 11 500 r/ min 的转速离心 12 min, 吸走上清液, 之后注入 蒸馏水离心洗掉附在细菌表面的铁离子分别加 入 7mL 05mol/ L NaOH 溶液在 100 水浴中加 热 25 min, 用 05 mol/ L 盐酸调节溶液 pH 70, 使 7 支管溶液体积均为 10 mL, 各加入 5mL 茚三 酮显色剂再置于 100 水浴中加热 15min, 冷却 6min之后利用紫外可见分光光度计测定溶液吸 光度, 并绘制菌体浓度与总吸光值的关系曲线 图 7 图 7 细菌裂解液总吸光度值与细菌 浓度 C 的关系曲线 Fig.7 Relationship between total absorbance of cell lysis solution and bacterial concentration C 该标准曲线经过线性拟合得到直线后的方程 为 y bx , 其中斜率 b 021可见, 试验中细菌 裂解液显色反应产物的吸光值与细菌的浓度成正 比, 被裂解的细菌数量越多, 裂解液的吸光值就越 大 4 结 论 经过试验, 得出了细菌浸出黄铜矿过程中矿 物表面细菌细胞裂解液吸光度的最佳测定条件 为 测量波长 560nm, 裂解时间25min, 溶液 pH 值 70, 加热时间 15 min, 冷却时间 6 min在最 佳条件下绘制出的矿物表面细菌吸附量标准曲 线, 表明细菌裂解液的吸光值与细菌的浓度成正 比 参考文献 [ 1 ]Schaeffer W I, Holbert P E, Umbreit W W. Attachment of thiobacillus thiooxidans tosulfurcrystals [ J ] .Journal Bacteriology, 1963, 85 137- 140. [ 2 ]Free M L, Oolman T , Nagpal, S, et al. Bioleaching of sulfideores -distinguishingbetweenindirectanddirect mechanism[ J] . Mineral Bio -p rocessing, 1991, 7 76- 89. [ 3 ]Murthy K S N,Natarajan K A.T he role of surface attachment of thiobacillus ferooxidans on the biooxidation of pyrite[ J] . Minerals Metallurgical Processing, 1992, 2 24- 29. [ 4 ]Ohmura N, Tsugita K, Koizumi J, et al. Sulfur -binding protein of flagella of thiobacillus ferrooxidans[ J] . Journal of Bacteriology, 1996, 178 19 5776- 5780. [ 5 ]Sampson M I, Blake II R C. Cell attachment and oxygen consumption of two strains of thiobacillus ferrooxidans[ J] . Minerals Engineering, 1999, 12 6 671- 686. [ 6 ]Sampson M I, Phillips C V, Blake R C. Influence of the attachment of acidophilic bacteria during the oxidation of mineral sulfides[ J] . Minerals Engineering, 2000, 13 4 373- 389. [ 7 ]Sampson M I, Blake II R C. Cell attachment and oxygen consumption of two strains of thiobacillus ferrooxidans[ J] . Minerals Engineering, 1999, 12 6 671- 686. [ 8 ]Escobar B,Jedlicki E, Wiertz J,et al. A for uating the proportion of free and attached bacteria in bioleaching of chalcopyrite with thiobacillus ferrooxidans[ J] . Hydrometallurgy, 1996, 40 1/ 2 1- 10. [ 9 ]Karan G, Natarjan K A, Modak J M . Estimation of mineral - adhered biomass of thiobacillus ferrooxidans by protein assay some problems and remedies[ J] . Hydrometallurgy , 1996, 42 2 169- 175. [ 10]周吉奎, 钮因健, 邱冠周, 等茚三酮比色法测定矿物表面 吸附浸矿细菌蛋白质含量[ J]中南大学学报 自然科学 版, 2003, 34 2 128- 131 Zhou J- i kui, Niu Yin -jian, Qiu Guan - zhou, et al . Protein contentofminera- l adheredbacteriumbyninhydrin colorimetric[ J] .JournalofCentralSouth University Science and Technology , 2003, 34 2 128 - 131. [ 11]杨洪英, 杨立细菌冶金学[ M]北京 化学工业出版社, 2006 10- 18 Yang Hong -ying,Yang Li.Bacterial metallurgy [ M ] . Beijing Chemical Industry Press, 2006 10- 18. 1002东北大学学报 自然科学版 第 31 卷