人造矿物纤维对肺泡巨噬细胞的毒作用研究(1).doc

人造矿物纤维对肺泡巨噬细胞的毒作用研究 王起恩1 韩春华2 吴卫东1 刘世杰1 神山宣彦3 【摘要】 目的 比较10种人造矿物纤维对肺泡巨噬细胞毒作用的差异。方法 选用日本纤维状物质研究协会提供的10种标准人造矿物纤维JFM纤维，在体外用豚鼠肺泡巨噬细胞AM作为靶细胞，分别对JFM纤维作用于AM后超氧阴离子自由基（O-2）、过氧化氢（H2O2）的产生，谷胱甘肽GSH及细胞内游离Ca2浓度的变化进行了测定。结果 10种JFM纤维中，大多数都可引起O-2和H2O2的产生增多、GSH含量下降及细胞内游离Ca2浓度升高，但其作用均低于温石棉。结论 JFM纤维的一般细胞毒性均低于温石棉。这些人造矿物纤维虽然作为石棉的代用品使用，但对机体仍会产生一定的有害作用。 【关键词】 细胞毒性，免疫 活性氧组分 人造矿物纤维 Studies on Cytotoxicity of Man-Made Mineral Fiber to Alveolar Macrophage Wang Qi′en*, Han Chunhua, Wu Weidong, et al. *Department of Occupational Health, Beijing Medical University, Beijing 100083 【Abstract】 Objective To compare the difference in cytotoxicity to human alveolar macrophage caused by ten kinds of man-made mineral fiber. s Ten kinds of man-made mineral fiber prepared by Japan Fibrous Materials Research Association JFM were used with alveolar macrophage extracted from guinea pigs in vitro as the target cells. Changes in the production of O-2 and H2O2, levels of glutathione and cellular free calcium ion Ca2 in alveolar macrophage were determined. Results Most of the 10 kinds of JFM fiber could cause increased production of O-2 and H2O2, reduction of levels of glutathione and increase of cellular free calcium ion Ca2 in alveolar macrophage, to a extent less than that caused by chrysotile. Conclusion In general, the cytotoxicity of JFM fiber was less than that of chrysotile. Although these mineral fiber could be used as substitutes for asbestos, they still could cause certain harm to human bodies. 【Key words】 Cytotoxicity, immunologic Reactive oxygen species Man-made mineral fiber 由于石棉已被确定为人类致癌物，因此近年来各种石棉代用品的开发和使用越来越多，其中以人造矿物纤维MMMF为目前最主要的石棉代用品。70年代末已有动物实验表明，MMMF对机体也存在有害作用，其中包括致癌作用，但迄今尚缺乏人群流行病学调查资料。本研究选用了日本纤维状物质研究协会JFMRA提供的10种标准人造矿物纤维JFM纤维以及UICC温石棉B，以肺泡巨噬细胞作为靶细胞，比较这10种JFM纤维产生活性氧等指标的作用，并对其细胞毒作用机制进行了探讨。 材料与方法 1.人造矿物纤维JFM纤维由日本中央劳动灾害防止协会提供（日本劳动省产业医学综合研究所神山宣彦博士研制），其名称及主要特性见表1。石棉为UICC温石棉B。 2. 细胞豚鼠肺泡巨噬细胞AM经支气管肺泡灌洗法获得。 3. 超氧阴离子自由基O-2的测定［1］取2106个AM，分别加入200 μg/ml的温石棉或JFM纤维，在37℃作用2小时后，用细胞色素C还原法测定还原型细胞色素C的生成量来代表O-2的产生量。 4. 过氧化氢H2O2的测定［2］取2106个AM，分别加入200 μg/ml的温石棉或JFM纤维，在37℃作用2小时后，用酚红氧化法测定H2O2的产生量。 5. 谷胱甘肽GSH含量的测定［3］取2106个AM，分别加入200 μg/ml的温石棉或JFM纤维，在37℃作用2小时后，超声破碎细胞，用荧光法测定GSH的含量。 6. 细胞内游离Ca2浓度的测定［4］取1106个AM，用Fluo-3/AM负载后，分别加入200 μg/ml的温石棉或JFM纤维，在37℃作用1小时后，用荧光分光光度计测定荧光强度。 7. 统计分析方法用Primer软件对数据进行t检验。 结果 JFM纤维对AM产生O-2、H2O2、GSH和游离Ca2含量的影响见表2。 讨论 在矿物纤维的致病机理中，活性氧被认为起了很重要的作用［5］。本研究结果表明，温石棉使AM产生的O-2和H2O2量均明显增多，而在10种JFM纤维中，除WO1外，其他均可使O-2的产生明显增多，但其中只有GW1、SC1、RW1、TO1、WO1和MG1产生的H2O2明显增多，其他4种JFM纤维则与对照的差异无显著性，提示不同的JFM纤维刺激AM产生活性氧的能力不同。与温石棉相比，在刺激O-2产生的过程中，10种JFM纤维均明显低于温石棉；而在刺激H2O2的产生过程中，只有GW1的作用与温石棉相似，其他JFM纤维产生活性氧的能力则均低于温石棉。有研究表明,陶瓷纤维RCF1～4、玻璃棉MMVF10和11、岩棉MMVF21和矿渣棉MMVF22均能使活性氧的产生增多［6］。岩棉MMVF21和玻璃纤维CODE100/475、陶瓷纤维碳化硅和RCF1可使AM产生少量的O-2［7］。结合本结果，可以认为大多数MMMF均可刺激活性氧的产生，除个别纤维外，其刺激程度均低于石棉。虽然MMMF通过活性氧致病的作用低于石棉，但仍存在不同程度的毒性作用，值得引起注意。 玻璃棉MMVF10和陶瓷纤维RCF1均可使AM中的GSH含量下降，但其程度均低于铁石棉[8]。本结果也表明，温石棉与PT1、TO1、SC1、WO1、MG1和RF2均可明显降低AM中的GSH含量。其中PT1和TO1的作用与温石棉相似，提示这些MMMF的确可使细胞产生氧化应激。 表1 实验所用矿物纤维的名称及长度与直径μm 样品名 中文名称 英文名称 长度 直径 GW1 玻璃棉 glass wool 20.22.58 0.883.10 RW1 岩棉 rock wool 16.52.51 1.802.32 MG1 微细玻璃纤维 micro glass fiber 3.02.22 0.242.35 RF1 耐火纤维陶瓷纤维 refractory fibers ceramic fiber 12.02.36 0.772.53 RF2 耐火纤维陶瓷纤维 refractory fibers ceramic fiber 11.01.96 1.102.00 RF3 耐火纤维富铝红柱石 refractory fibers mullite fiber 11.01.75 2.401.37 PT1 钛酸钾须晶 potassium titanate whisker 6.02.04 0.351.51 SC1 碳化硅须晶 silicon carbide whisker 6.42.45 0.301.58 TO1 氧化钛须晶 titanium oxide whisker 2.12.00 0.141.53 WO1 硅灰石天然矿物纤维 wollastonite nature mineral fiber 10.52.03 1.001.72 表2 标准人造矿物纤维对豚鼠肺泡巨噬细胞产生O-2、H2O2、谷胱甘肽和 游离Ca2的影响s，n4 序位 矿物纤维 还原型细 胞色素C μmol/L 矿物 纤维 H2O2 μmol/L 矿物 纤维 谷胱甘肽 μg/106 细胞 矿物 纤维 游离Ca2 nmol/L 1 温石棉 14.50 0.20** GW1 4.033 0.266** PT1 0.188 0.007** 温石棉 1 563.4 264.9** 2 RW1 11.34 1.19**△△ 温石棉 3.948 0.461** 温石棉 0.198 0.017** SC1 640.1 103.3**△△ 3 RF2 11.13 0.87**△△ SC1 2.200 0.266**△ TO1 0.221 0.016** TO1 425.7 26.5**△△ 4 RF1 10.98 0.58**△△ RW1 2.157 0.128*△△ SC1 0.261 0.020**△△ PT1 418.5 36.2**△△ 5 RF3 10.82 0.67**△△ TO1 2.157 0.222*△△ WO1 0.280 0.017**△△ MG1 380.9 28.0**△△ 6 PT1 10.60 1.02**△△ WO1 2.157 0.221*△△ MG1 0.340 0.011**△△ RF3 363.8 43.9**△△ 7 TO1 10.51 0.68**△△ MG1 2.072 0.074*△△ RF2 0.430 0.012*△△ RF2 347.1 30.1**△△ 8 MG1 10.34 0.93**△△ PT1 1.859 0.074△△ RF3 0.448 0.013△△ RF1 340.0 24.1**△△ 9 GW1 10.13 0.33**△△ RF3 1.859 0.147△△ GW1 0.452 0.013△△ RW1 329.4 23.7*△△ 10 SC11 9.86 0.30**△△ RF2 1.817 0.074△△ RF1 0.455 0.021△△ WO1 329.3 55.3△△ 11 WO1 6.96 0.65△△ RF1 1.689 0.074△△ RW1 0.488 0.021△△ GW1 259.1 28.8△△ 12 空白对照组 6.740.58 空白对照组 1.4750.266 空白对照组 0.4880.033 空白对照组 256.333.1 与对照组比较*P0.05，**P0.01；与温石棉组比较△P0.05，△△P0.01 本结果还表明，温石棉可使AM中游离Ca2升高5倍，而10种JFM纤维中，除WO1和GW1外都可使AM中游离Ca2水平发生不同程度的升高，但均低于温石棉的效应。提示多数MMMF可引起细胞内游离Ca2稳态失调，这也可能是MMMF引起细胞毒作用包括致癌作用的一种机制。 早期研究认为，纤维的几何形状、长度和直径、表面积等与其致病性有密切关系。我们根据表1中各种纤维的长度和直径的乘积，算出每根纤维的比表面积。在同一重量的条件下，凡是细小的纤维，其实际根数也越多，其比表面积也越大。我们按计算所得的比表面积大小先排队，然后再与4个指标的排队结果相对应，这时看到GSH和游离Ca2与比表面积前4位排序的结果总数十分相似，表明这两个指标与JFM纤维的比表面积有着十分密切的关系。这是因为分散度大，比表面积大，表面多带负电荷，因而吸附细胞蛋白也多，其细胞毒性也必然相对较大。然而与产生活性氧的两个指标的排序相比，则似乎没有明确的关系。由此可知，JFM纤维虽均可刺激AM产生O-2和H2O2，但与长度直径所得的比表面积无关，表明这种刺激AM产生O-2和H2O2的机制与MMMF的比表面积大小无关，而是通过其他途径。此种排序比较的方法对多数致病性指标探索其因果关系时，不失为一种有益的尝试。 综上所述，本实验通过4个毒性指标，初步认为10种JFM纤维的毒性均低于温石棉，但由于10种JFM纤维在不同指标中所表现出的毒作用程度不同，仅用这4个指标很难区别出哪种纤维对机体的危害最大。因此有必要对这10种JFM纤维的毒性采用多种方法进行观察，最后再综合分析判断。 本研究受日中医学协会资助 作者单位1 北京医科大学劳动卫生教研室 100083，2 北京体育师范学院，3 日本劳动省产业医学综合研究所 参考文献 1 Greenwald RA. 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