矿物粉尘诱导的肺泡巨噬细胞因子对肺成纤维细胞作用的研究.doc

矿物粉尘诱导的肺泡巨噬细胞因子对肺成纤维细胞作用的研究 周建华1 周立人1 杨吉成2 陈跃进1 章瑜1 盛伟华2 【摘要】 目的 了解矿物粉尘诱导的肺泡巨噬细胞AM因子在肺纤维化中的作用。方法 用肺泡灌洗法获取兔AM，经体外培养,取其上清液,分别用同位素掺入法和四甲基偶氮唑盐比色法测定上清液中肿瘤坏死因子TNF和白细胞介素-6IL-6的活性,并将此上清液与人胚肺成纤维细胞WI-38培养，用氚-胸腺嘧啶3H-TdR、14碳-脯氨酸14C-Pro测定成纤维细胞增殖和胶原合成，用氯氨-T法测定总羟脯氨酸HOP含量。结果 石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液均能促进肺成纤维细胞增殖和胶原合成，用3H-TdR掺入的每分钟计数cpm均值分别为6 584、3 848和6 893100 g浓度组，14C-Pro掺入法cpm均值分别为27 952、13 416和18 538200 g浓度组，明显高于对照组。AM上清液作用的肺成纤维细胞培养液总HOP含量分别为22.41、24.00和21.39 g/ml200 g浓度组，明显高于对照组12.91 g/ml。石英、石棉和铀矿尘等矿物粉尘能刺激AM释放TNF和IL-6，其活性显著高于对照组，TNF活性分别为1 396、1 198和852 U/ml；IL-6活性分别为1 336、1 511和1 335 U/ml。抗TNF抗体和干扰素IFN能抑制肺成纤维细胞增殖，IFN的作用弱于抗TNF抗体，对胶原合成的抑制作用，IFN强于抗TNF抗体。结论 矿物粉尘所致的肺纤维化与TNF和IL-6的异常表达有关。抗TNF抗体和IFN能拮抗TNF和IL-6的作用。 【关键词】 矿物质 粉尘 巨噬细胞，肺泡 Studies on Effects of Cytokine Released from Alveolar Macrophage Induced by Mineral Dust on Lung Fibroblast Zhou Jianhua*, Zhou Liren, Yang Jicheng, et al. *Department of Occupational Health, Suzhou Medical College, Suzhou 215007 【Abstract】 Objective To understand the role of cytokine released from alveolar macrophage AM in lung fibrosis caused by mineral dust. s Rabbits AM obtained by lavage was cultured with mineral dust in vitro. Activities of tumor necrosis factor TNF and interleukin 6 IL-6 in its supernatant were determined with isotope labelling and MTT colorimetry, respectively. Human fetal lung fibroblast WI-138 was cultured with this supernatant. Proliferation of fibroblast and synthesis of collagen were examined by 3H-thymidine 3H-TdR and 14C-proline 14C-Pro incorporation and its total hydroxyproline HOP level was analyzed by chloramine-T . Results Proliferation of lung fibroblast and synthesis of collagen could be enhanced by the supernatant containing AM induced by quartz, asbestos and uranium mineral dust, with 3H-TdR incorporated counts per minute cpm of 6 584, 3 848 and 6 893 in the group of 100 g 3H-TdR and 14C-Pro incorporated 27 952, 13 416 and 18 538 in the group of 200 g respectively, which were significantly higher than those in the control group. Total HOP levels in the culture media for lung fibroblast enhanced by AM supernatant were 22.41, 24.00 and 21.39 g/ml, respectively, and was significantly higher than that in the control group 12.91 g/ml. Release of TNF and IL-6 could be stimulated by mineral dust, such as quartz, asbestos and uranium mineral dust, and their activities were significantly higher than those in the control group, with those of 1 396, 1 198 and 852 U/ml in TNF group and 1 336, 1511 and 1 335 U/ml in IL-6 group, respectively. Proliferation of lung fibroblast and synthesis of collagen could be inhibited by antibody against TNF and interferon-r gamma, and the effect of the latter was weaker than that of the er on inhibition of fibroblast proliferation and the effect on collagen synthesis was just in the opposite direction. Conclusion Lung fibrosis caused by mineral dust correlated with abnormal expression of TNF and IL-6. Antibody against TNF and gamma interferon could antagonize the effect of NTF and IL-6. 【Key words】 Minerals Dust Macrophages, alveolar 关于石英、石棉和铀矿尘引起肺纤维化的机理至今尚未完全清楚。近年来研究认为,肺泡巨噬细胞alveolar macrophage，AM释放的细胞因子,如肿瘤坏死因子tumor neceosis factor,TNF、血小板生长因子platelte derived growth factor,PDGF、白细胞介素等在尘肺纤维化中起着十分重要作用［1，2］。我们研究了石英、石棉和铀矿粉尘诱导的AM上清液中细胞因子TNF和白细胞介素-6interleukin-6，IL-6对肺成纤维细胞的作用以及抗TNF抗体和干扰素interferen-gamma,IFN对活化的肺成纤维细胞的抑制作用，旨在探索AM因子在肺纤维化中的作用，藉以加深了解肺纤维化的发病机理，并为尘肺病的防治提供实验依据。 材料与方法 一、材料 1.粉尘悬液国际标准石英粉DQ12和国际标准温石棉UICC由美国NIOSH提供; 铀矿粉尘由中国核工业总公司711矿提供, 含游离SiO2 34 、U3O8 1,粒径5 m的占91;二氧化钛TiO2由中国预防医学科学院提供, 纯度99, 粒径5 m。称取上述粉尘，用Hank无Ca2、Mg2离子配成2 mg/ml混悬液，高压灭菌备用，使用前充分混匀。 2.主要试剂RPMI 1640培养基为美国GIBCO产品,氚-胸腺嘧啶3H-TdR由上海原子能研究所提供,14碳-脯氨酸14C-Pro由北京原子能研究所提供,四甲基偶氮唑盐MTT为Fluca公司产品,TNF标准品和抗TNF抗体由上海第二军医大学提供,IL-6标准品由法国KleinB博士惠赠,IFN由本院基因工程研究室惠赠。 3.实验细胞AM是用改良的Myrivk和Fariss［3］方法,取自雄性健康的新西兰大白兔肺脏；人胚肺成纤维细胞WI-38由中国科学院上海生物研究所细胞库提供；测定TNF活性的L929细胞引自苏州医学院基因工程研究室；测定IL-6活性的B9细胞由珠海中通生物技术公司惠赠。 二、方法 1.粉尘诱导的AM上清液制备AM经纯化后,用无血清RPMI 1640培养液配成细胞浓度为1106/ml上清液，接种于24孔培养板中德国NUNC公司生产，然后分别加入不同剂量的石英尘、石棉纤维和铀矿尘悬液，使终浓度分别为25、50、100和200 g/ml。同时设培养液、TiO2、脂多糖LPS对照。置37℃、5 CO2培养箱中培养24小时后, 离心1 000 r/min,10分钟, 用0.22 m 微孔滤膜去除大分子，-30℃冰箱保存备用。 2.肺成纤维细胞增殖和胶原合成试验分别用3H-TdR掺入法和14C-Pro掺入法。细胞收集后在BECKMANLS 6800液闪仪上测每分钟计数cpm。并用氯氨T法测定肺成纤维细胞总羟脯氨酸含量。 3.细胞因子活性测定TNF活性检测用同位素标记法，IL-6活性检测用MTT比色法。 细胞因子活性单位的计算采用概率单位法。 4.抗TNF抗体，IFN对肺成纤维细胞增殖和胶原合成抑制试验方法同方法2。 5.统计学处理实验所得数据采用计算机Office组件进行方差分析等检验处理和相关回归比较。 结果 1.矿物尘诱导的AM上清液对WI-38细胞生长增殖的影响表1不同浓度石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液对WI-38细胞的增殖作用与TiO2对照组比较,差异有非常显著性P0.01。同一浓度（25 g/ml）、不同稀释度也显示相似结果，石英组AM上清液1∶2稀释度cpm为4 7501 560，是TiO2对照组的9.5倍。石棉纤维组1∶2稀释度cpm为2 669321，是TiO2对照组的5.3倍。铀矿尘组1∶2稀释度cpm为3 201472，是TiO2对照组的6.1倍。实验组与对照组比较,差异有非常显著性P0.01。 表1 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞增殖的影响 成纤维细胞3H-TdR摄入，每分钟计数，s 组别 粉尘浓度g/ml 25 50 100 200 DQ12石英粉 3 7701 136** 4 985845** 6 5481 352** 7 168401** UICC温石棉 3 3371 077** 3 692215** 3 848454** 4 1621 057** 铀矿尘 3 889881** 3 810387** 6 8931 222** 7 7061 305** TiO2 499148 36271 26369 46869 **与TiO2组比P0.01，下同 2.铀矿尘诱导的AM上清液对WI-38细胞胶原合成的影响表2不同浓度的石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液能明显促进WI-38细胞胶原合成，各浓度组cpm值明显高于TiO2对照组P0.01,但无剂量反应关系r0.742,P0.05。3种粉尘之间差异无显著性P0.05。 表2 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞胶原合成的影响 成纤维细胞14C-Pro摄入，每分钟计数，s 组别 粉尘浓度g/ml 25 50 100 200 DQ12石英粉 20 2592 124** 21 863275** 24 694236** 27 9521 690** UICC温石棉 11 6752 027** 13 666201** 13 580156** 14 1551 392** 铀矿尘 16 953946** 17 9901 991** 19 805531** 18 850756** TiO2 71946 69648 73298 75237 3.矿物尘诱导的AM上清液培养的WI-38细胞总羟脯氨酸HOP含量表3不同浓度石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液与WI-38细胞培养后细胞HOP含量显著高于TiO2对照组P0.01，浓度与效应间有剂量反应关系P0.05。但3种粉尘比较，差异无显著性P0.05。 4.矿物尘诱导的AM上清液中TNF和IL-6活性表4石英、石棉和铀矿尘均诱导AM释放TNF和IL-6，其活性明显高于TiO2对照组P0.01和LPS阳性对照组P0.01，并有一定的剂量反应关系P0.05。但3种粉尘之间差异无显著性P0.05。 表3 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液对人胚肺成 纤维细胞中总羟脯氨酸含量的影响g/ml，s 组别 粉尘浓度g/ml 25 50 100 200 DQ12石英粉 19.882.76** 20.822.55** 21.351.98** 22.412.52** UICC温石棉 20.070.85** 21.001.15** 22.962.38** 24.001.86** 铀矿尘 19.221.12** 19.911.16** 21.103.11** 21.293.50** TiO2 12.121.77 12.792.31 12.801.95 12.911.89 5.抗TNF抗体和IFN对矿物尘活化的WI-38细胞增殖和胶原合成的影响表5抗TNF抗体和IFN与矿物尘诱导的AM上清液加入WI-38细胞培养后, WI-38细胞的增殖和胶原合成明显抑制，但IFN对WI-38细胞增殖的抑制作用弱于抗TNF抗体，对WI-38细胞胶原合成的抑制作用强于抗TNF抗体，与3种粉尘诱导的AM上清液使WI-38细胞增殖和胶原合成相比差异有显著性。 表4 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子和 白细胞介素-6的活性U/ml 组别 25 g/ml 50 g/ml 100 g/ml 200 g/ml 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 DQ12石英粉 50522** 1 210 30** 66418** 1 250 266** 79166** 1 320 28** 1 369 378** 1 336 28** UICC温 石棉 6206** 1 331 41** 74417** 1 250 24** 924** 1 395 32** 1 198 126** 1 511 40** 铀矿尘 5256** 998 26** 65869** 1 058 24** 73766** 1 262 28** 852 135** 1 335 29** TiO2 17 25 19 30 20 29 24 25 脂多糖300 U/ml 表5 抗肿瘤坏死因子抗体、干扰素对活化的人胚肺成纤维细胞增殖和 胶原合成的影响每分钟计数，s 组别 成纤维细胞3H-TdR摄入 成纤维细胞14C-Pro摄入 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 DQ12石英粉 4750187 4186277 3041126 2231236 4590158 3910812 3376567 2818485 加抗肿瘤坏死因子 505 28** 503 18** 47142** 59923** 2037973* 2176123* 1677176* 1346392* 加干扰素 1502187* 1712344* 1750463* 2056101 300 12** 3649** 329 31** 4507** UICC温石棉 2669321 2418179 3285729 248697 3384406 3078460 2616325 2092305 加抗肿瘤坏死因子 698 48** 823103** 58753** 54323** 2866129 1870 70* 1015189* 91825* 加干扰素 757144* 1448148* 186565* 180152 3317** 391 15** 298 36** 39029** 铀矿尘 3201472 3189145 2370349 1998276 49611924 42161635 35841308 2867925 加抗肿瘤坏死因子 604 61** 483 96** 57296** 76963** 2329249* 2669 93* 1658368* 1435125* 加干扰素 1174148* 1203154* 1512116* 1748114 53278* 51978* 63832* 637136* 与不加抗肿瘤坏死因子抗体或干扰素组cpm比*P0.05，**P0.01 讨论 接触石英、石棉和铀矿尘引起的纤维化是一种复杂的反应。本研究结果显示，石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液能刺激肺成纤维细胞增殖，促进胶原合成增加，肺成纤维细胞总HOP含量明显升高。这些矿物尘均能诱导AM分泌TNF和IL-6，且随粉尘浓度增高而活性增加，有剂量反应关系，但3种粉尘之间无差别。说明AM释放的TNF和IL-6的量与这几种粉尘的性质无关。TNF-和IL-1与矽肺病变程度有密切关系。Piguet等［4］用博莱霉素诱发的鼠矽肺模型，其肺部TNF- mRNA水平明显升高,胶原累积，注入抗TNF抗体后可明显减少胶原在肺部的沉着，使肺纤维化程度减轻。作者认为TNF在二氧化硅所致的肺纤维化中起重要作用。IL-6在粉尘致纤维化过程中与TNF有协同作用。TNF、IL-6的异常分泌又必然引起体内多种细胞因子之间相互协同、制约作用的紊乱，加速肺纤维化的进展。 本研究用抗TNF抗体和IFN与活化的WI-38细胞一起培养,证明了它们的拮抗作用。抗TNF抗体对WI-38细胞增殖的抑制作用比IFN更明显，但IFN抑制胶原合成的能力比抗TNF抗体强，说明两者的作用点是不同的。体内肺成纤维细胞活化机制受复杂的细胞因子网络调节，且其本身又有反馈调节炎性细胞功能。已证明TNF能以剂量依赖方式刺激静止的肺成纤维细胞增殖，还能刺激快速分裂的成纤维细胞增殖，加入抗TNF抗体能明显使细胞在两个不同时期相受到抑制。胶原合成的体外实验已证明,成纤维细胞可释放Ⅰ型、Ⅲ型胶原N末端前肽，IFN能降低稳定状态Ⅰ型前胶原mRNA浓度［5］。所以加入IFN后胶原减少比较明显。IFN是1种调节细胞功能的小分子多肽，Varga等［6］的研究认为，IFN能阻止促成纤维细胞增殖的细胞因子释放，并在转录水平上关闭胶原基因的表达,从而抑制成纤维细胞胶原的生成。 肺成纤维细胞的增殖和胶原合成受巨噬细胞的调控，这种调节作用是双向的［7］，正常情况下，成纤维细胞活性依赖于这些细胞因子的平衡，如果自稳定机制失去平衡,就会导致纤维化发生。巨噬细胞作为机体重要的功能调节细胞，其释放的细胞因子如何在基因水平上进行调控，还有待进一步研究。 作者单位1 苏州医学院劳动卫生职业病教研室 215007，2 苏州医学院基因工程研究室 参考文献 1 Carr P, Lophonte P. 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