矿物粉尘诱导的肺泡巨噬细胞因子对肺成纤维细胞作用的研究(1).doc

矿物粉尘诱导的肺泡巨噬细胞因子对肺成纤维细胞作用的研究 周建华1 周立人1 杨吉成2 陈跃进1 章瑜1 盛伟华2 【摘要】 目的 了解矿物粉尘诱导的肺泡巨噬细胞AM因子在肺纤维化中的作用。方法 用肺泡灌洗法获取兔AM，经体外培养,取其上清液,分别用同位素掺入法和四甲基偶氮唑盐比色法测定上清液中肿瘤坏死因子TNF和白细胞介素-6IL-6的活性,并将此上清液与人胚肺成纤维细胞WI-38培养，用氚-胸腺嘧啶3H-TdR、14碳-脯氨酸14C-Pro测定成纤维细胞增殖和胶原合成，用氯氨-T法测定总羟脯氨酸HOP含量。结果 石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液均能促进肺成纤维细胞增殖和胶原合成，用3H-TdR掺入的每分钟计数cpm均值分别为6 584、3 848和6 893100 μg浓度组，14C-Pro掺入法cpm均值分别为27 952、13 416和18 538200 μg浓度组，明显高于对照组。AM上清液作用的肺成纤维细胞培养液总HOP含量分别为22.41、24.00和21.39 μg/ml200 μg浓度组，明显高于对照组12.91 μg/ml。石英、石棉和铀矿尘等矿物粉尘能刺激AM释放TNF和IL-6，其活性显著高于对照组，TNF活性分别为1 396、1 198和852 U/ml；IL-6活性分别为1 336、1 511和1 335 U/ml。抗TNF抗体和γ干扰素IFNγ能抑制肺成纤维细胞增殖，IFNγ的作用弱于抗TNF抗体，对胶原合成的抑制作用，IFNγ强于抗TNF抗体。结论 矿物粉尘所致的肺纤维化与TNF和IL-6的异常表达有关。抗TNF抗体和IFNγ能拮抗TNF和IL-6的作用。 【关键词】 矿物质 粉尘 巨噬细胞，肺泡 Studies on Effects of Cytokine Released from Alveolar Macrophage Induced by Mineral Dust on Lung Fibroblast Zhou Jianhua*, Zhou Liren, Yang Jicheng, et al. *Department of Occupational Health, Suzhou Medical College, Suzhou 215007 【Abstract】 Objective To understand the role of cytokine released from alveolar macrophage AM in lung fibrosis caused by mineral dust. s Rabbit′s AM obtained by lavage was cultured with mineral dust in vitro. Activities of tumor necrosis factor TNF and interleukin 6 IL-6 in its supernatant were determined with isotope labelling and MTT colorimetry, respectively. Human fetal lung fibroblast WI-138 was cultured with this supernatant. Proliferation of fibroblast and synthesis of collagen were examined by 3H-thymidine 3H-TdR and 14C-proline 14C-Pro incorporation and its total hydroxyproline HOP level was analyzed by chloramine-T . Results Proliferation of lung fibroblast and synthesis of collagen could be enhanced by the supernatant containing AM induced by quartz, asbestos and uranium mineral dust, with 3H-TdR incorporated counts per minute cpm of 6 584, 3 848 and 6 893 in the group of 100 μg 3H-TdR and 14C-Pro incorporated 27 952, 13 416 and 18 538 in the group of 200 μg respectively, which were significantly higher than those in the control group. Total HOP levels in the culture media for lung fibroblast enhanced by AM supernatant were 22.41, 24.00 and 21.39 μg/ml, respectively, and was significantly higher than that in the control group 12.91 μg/ml. Release of TNF and IL-6 could be stimulated by mineral dust, such as quartz, asbestos and uranium mineral dust, and their activities were significantly higher than those in the control group, with those of 1 396, 1 198 and 852 U/ml in TNF group and 1 336, 1511 and 1 335 U/ml in IL-6 group, respectively. Proliferation of lung fibroblast and synthesis of collagen could be inhibited by antibody against TNF and interferon-r gamma, and the effect of the latter was weaker than that of the er on inhibition of fibroblast proliferation and the effect on collagen synthesis was just in the opposite direction. Conclusion Lung fibrosis caused by mineral dust correlated with abnormal expression of TNF and IL-6. Antibody against TNF and gamma interferon could antagonize the effect of NTF and IL-6. 【Key words】 Minerals Dust Macrophages, alveolar 关于石英、石棉和铀矿尘引起肺纤维化的机理至今尚未完全清楚。近年来研究认为,肺泡巨噬细胞alveolar macrophage，AM释放的细胞因子,如肿瘤坏死因子tumor neceosis factor,TNF、血小板生长因子platelte derived growth factor,PDGF、白细胞介素等在尘肺纤维化中起着十分重要作用［1，2］。我们研究了石英、石棉和铀矿粉尘诱导的AM上清液中细胞因子TNF和白细胞介素-6interleukin-6，IL-6对肺成纤维细胞的作用以及抗TNF抗体和γ干扰素interferen-gamma,IFNγ对活化的肺成纤维细胞的抑制作用，旨在探索AM因子在肺纤维化中的作用，藉以加深了解肺纤维化的发病机理，并为尘肺病的防治提供实验依据。 材料与方法 一、材料 1.粉尘悬液国际标准石英粉DQ12和国际标准温石棉UICC由美国NIOSH提供; 铀矿粉尘由中国核工业总公司711矿提供, 含游离SiO2 34 、U3O8 1,粒径0.05。 表2 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞胶原合成的影响 成纤维细胞14C-Pro摄入，每分钟计数，s 组别 粉尘浓度μg/ml 25 50 100 200 DQ12石英粉 20 2592 124** 21 863275** 24 694236** 27 9521 690** UICC温石棉 11 6752 027** 13 666201** 13 580156** 14 1551 392** 铀矿尘 16 953946** 17 9901 991** 19 805531** 18 850756** TiO2 71946 69648 73298 75237 3.矿物尘诱导的AM上清液培养的WI-38细胞总羟脯氨酸HOP含量表3不同浓度石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液与WI-38细胞培养后细胞HOP含量显著高于TiO2对照组P0.01，浓度与效应间有剂量反应关系P0.05。 4.矿物尘诱导的AM上清液中TNF和IL-6活性表4石英、石棉和铀矿尘均诱导AM释放TNF和IL-6，其活性明显高于TiO2对照组P0.01和LPS阳性对照组P0.01，并有一定的剂量反应关系P0.05。 表3 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液对人胚肺成 纤维细胞中总羟脯氨酸含量的影响μg/ml，s 组别 粉尘浓度μg/ml 25 50 100 200 DQ12石英粉 19.882.76** 20.822.55** 21.351.98** 22.412.52** UICC温石棉 20.070.85** 21.001.15** 22.962.38** 24.001.86** 铀矿尘 19.221.12** 19.911.16** 21.103.11** 21.293.50** TiO2 12.121.77 12.792.31 12.801.95 12.911.89 5.抗TNF抗体和IFNγ对矿物尘活化的WI-38细胞增殖和胶原合成的影响表5抗TNF抗体和IFNγ与矿物尘诱导的AM上清液加入WI-38细胞培养后, WI-38细胞的增殖和胶原合成明显抑制，但IFNγ对WI-38细胞增殖的抑制作用弱于抗TNF抗体，对WI-38细胞胶原合成的抑制作用强于抗TNF抗体，与3种粉尘诱导的AM上清液使WI-38细胞增殖和胶原合成相比差异有显著性。 表4 不同浓度矿物尘诱导的肺泡巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子和 白细胞介素-6的活性U/ml 组别 25 μg/ml 50 μg/ml 100 μg/ml 200 μg/ml 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 DQ12石英粉 50522** 1 210 30** 66418** 1 250 266** 79166** 1 320 28** 1 369 378** 1 336 28** UICC温 石棉 6206** 1 331 41** 74417** 1 250 24** 924** 1 395 32** 1 198 126** 1 511 40** 铀矿尘 5256** 998 26** 65869** 1 058 24** 73766** 1 262 28** 852 135** 1 335 29** TiO2 17 25 19 30 20 29 24 25 脂多糖300 U/ml 表5 抗肿瘤坏死因子抗体、γ干扰素对活化的人胚肺成纤维细胞增殖和 胶原合成的影响每分钟计数，s 组别 成纤维细胞3H-TdR摄入 成纤维细胞14C-Pro摄入 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 DQ12石英粉 4750187 4186277 3041126 2231236 4590158 3910812 3376567 2818485 加抗肿瘤坏死因子 505 28** 503 18** 47142** 59923** 2037973* 2176123* 1677176* 1346392* 加γ干扰素 1502187* 1712344* 1750463* 2056101 300 12** 3649** 329 31** 4507** UICC温石棉 2669321 2418179 3285729 248697 3384406 3078460 2616325 2092305 加抗肿瘤坏死因子 698 48** 823103** 58753** 54323** 2866129 1870 70* 1015189* 91825* 加γ干扰素 757144* 1448148* 186565* 180152 3317** 391 15** 298 36** 39029** 铀矿尘 3201472 3189145 2370349 1998276 49611924 42161635 35841308 2867925 加抗肿瘤坏死因子 604 61** 483 96** 57296** 76963** 2329249* 2669 93* 1658368* 1435125* 加γ干扰素 1174148* 1203154* 1512116* 1748114 53278* 51978* 63832* 637136* 与不加抗肿瘤坏死因子抗体或γ干扰素组cpm比*P0.05，**P0.01 讨论 接触石英、石棉和铀矿尘引起的纤维化是一种复杂的反应。本研究结果显示，石英、石棉和铀矿尘诱导的AM上清液能刺激肺成纤维细胞增殖，促进胶原合成增加，肺成纤维细胞总HOP含量明显升高。这些矿物尘均能诱导AM分泌TNF和IL-6，且随粉尘浓度增高而活性增加，有剂量反应关系，但3种粉尘之间无差别。说明AM释放的TNF和IL-6的量与这几种粉尘的性质无关。TNF-α和IL-1β与矽肺病变程度有密切关系。Piguet等［4］用博莱霉素诱发的鼠矽肺模型，其肺部TNF-α mRNA水平明显升高,胶原累积，注入抗TNF抗体后可明显减少胶原在肺部的沉着，使肺纤维化程度减轻。作者认为TNF在二氧化硅所致的肺纤维化中起重要作用。IL-6在粉尘致纤维化过程中与TNF有协同作用。TNF、IL-6的异常分泌又必然引起体内多种细胞因子之间相互协同、制约作用的紊乱，加速肺纤维化的进展。 本研究用抗TNF抗体和IFNγ与活化的WI-38细胞一起培养,证明了它们的拮抗作用。抗TNF抗体对WI-38细胞增殖的抑制作用比IFNγ更明显，但IFNγ抑制胶原合成的能力比抗TNF抗体强，说明两者的作用点是不同的。体内肺成纤维细胞活化机制受复杂的细胞因子网络调节，且其本身又有反馈调节炎性细胞功能。已证明TNF能以剂量依赖方式刺激静止的肺成纤维细胞增殖，还能刺激快速分裂的成纤维细胞增殖，加入抗TNF抗体能明显使细胞在两个不同时期相受到抑制。胶原合成的体外实验已证明,成纤维细胞可释放Ⅰ型、Ⅲ型胶原N末端前肽，IFNγ能降低稳定状态Ⅰ型前胶原mRNA浓度［5］。所以加入IFNγ后胶原减少比较明显。IFNγ是1种调节细胞功能的小分子多肽，Varga等［6］的研究认为，IFNγ能阻止促成纤维细胞增殖的细胞因子释放，并在转录水平上关闭胶原基因的表达,从而抑制成纤维细胞胶原的生成。 肺成纤维细胞的增殖和胶原合成受巨噬细胞的调控，这种调节作用是双向的［7］，正常情况下，成纤维细胞活性依赖于这些细胞因子的平衡，如果自稳定机制失去平衡,就会导致纤维化发生。巨噬细胞作为机体重要的功能调节细胞，其释放的细胞因子如何在基因水平上进行调控，还有待进一步研究。 作者单位1 苏州医学院劳动卫生职业病教研室 215007，2 苏州医学院基因工程研究室 参考文献 1 Carr P, Lophonte P. 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