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2015 年 12 月，第 21 卷，第 4期，603-607页 December 2015，Vol. 21，No.4， pp. 603-607 高校地质学报 Geological Journal of China Universities 细菌作用下球状碳酸盐矿物形成的新途径 以柠檬酸杆菌GW-M菌株为例 郭文文 1,2，李福春2*，马 恒2，徐青龙2 1. 枣庄学院 旅游与资源环境学院， 枣庄 277160； 2. 南京农业大学 资源与环境科学学院， 南京 210095 摘要为了探讨细菌作用下碳酸盐矿物的形成机理，本文对分离自土壤的一株柠檬酸杆菌GW-M菌株进行了为期165 d的培养 实验。利用 X-射线衍射技术对沉淀物的矿物成分进行了测定，利用扫描电子显微镜对沉淀物的形态进行了系统的观察。结果 表明，GW-M菌株诱导形成的碳酸盐矿物（方解石和单水碳钙石）具有多种形态共存并以球状为主的特点，而无菌对照实验产 物中的矿物形态则比较单一。在GW-M菌株的作用下，通过以下三条途径均可能形成球状矿物 （1）单个哑铃→两端生长→ 球； （2）两个交叉的哑铃→两个哑铃的两端各自生长→球； （3）三个交叉的哑铃→三个哑铃的两端各自生长→球。 关键词柠檬酸杆菌；碳酸盐矿物；哑铃形；球状 中图分类号 P611文献标识码A文章编号1006-7493（2015）04-0603-05 The New ation Ways of Spherical Carbonate Minerals Induced by Bacteria Example of Citrobacter sp. Strain GW-M GUO Wenwen1, 2, LI Fuchun2*, MA Heng2, XU Qinglong2 1. Department of Tourism, Resources and Environment, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China 2. College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China Abstract In order to understand the ation mechanism of carbonate minerals induced by microbes, culture experiments with a duration of 165 days were pered under the mediation of strain GW-M isolated from soil. Mineral species were determined by X-ray diffraction, and the morphologies of precipitated carbonates were observed using scanning electron microscopy. The results showed that the carbonate minerals calcite and monohydrocalcite induced by strain GW-M featured various morphologies, mainly spherical morphology. In contrast, morphologies of carbonate minerals ed in the aseptic experiments were relatively simple. Three ways might lead to the ation of spherical minerals under the action of strain GW-M. 1 The first way was single dumbbell-shaped minerals with fine crystals gathered faster on both ends than the middle part of the dumbbell, changing dumbbell-shaped minerals into spherical ones. 2 The second way was two crossed dumbbell-shaped minerals with fine crystals gathered faster on both ends than the middle part of the two dumbbells, resulting in spherical minerals. 3 The final way was three crossed dumbbell-shaped minerals with fine crystals gathered faster on both ends than the middle part of the three dumbbells, eventually evolving into spherical minerals. Key words Citrobacter sp.; carbonate minerals; dumbbell-like morphology; spherical morphology Corresponding author LI Fuchun, Professor; E-mail fchli DOI 10.16108/j.issn1006-7493.2015209 _____________________________ 收稿日期 2015-05-04；修回日期2015-10-15 基金项目国家自然科学基金项目（41172308） ；枣庄学院博士科研启动基金（2013BS03） ；中国科学院黄土与第四纪地质国家重点实验室开放课题 （SKLLQG1309）联合资助 作者简介郭文文，女，1983年生，博士，讲师，主要从事地质微生物学和土壤地球化学研究；E-mail wwaxmt *通讯作者李福春，教授；E-mailfchli 高校地质学报2 1 卷 4 期 碳酸盐矿物是自然界中分布最广泛的矿物类 型之一，在地质演化中占有重要地位。微生物诱 导碳酸盐矿物沉淀是地质微生物学的研究热点之 一（王红梅等，2013） 。微生物能够通过其代谢活 动提高细胞周围微环境的pH值和溶液中CO32-浓 度，进而使碳酸盐矿物的饱和度指数增大并沉淀 （ 王红梅等，2013 ） 。研究表明，几乎所有的微生物都 具有促进碳酸盐矿物形成的能力（ Boquetetal.,1973 ） 。 球状结构广泛分布于自然界的土壤和沉积物 中（ Wright and Oren, 2005; Mastandrea et al., 2006 ） ， 其中碳酸盐组成的球状结构格外引人关注。越来 越多的研究表明，一些微生物在球状碳酸盐矿物 的形成过程中发挥了重要作用 （Wright and Oren, 2005; Rodriguez-Navarro et al., 2007; 李福春等， 2011） 。Warthmann等曾描述过球状碳酸盐矿物形 成的全过程许多微晶在细菌细胞的两端分别聚 集成卵形集合体，当两端均发展为卵形则呈现出 哑铃形结构； “哑铃”进一步生长，末端连接起来 而形成球状矿物（Warthmann et al., 2000） 。李福春 等在梭菌SN-1菌株的培养实验中发现，单个细菌 细胞和两个垂直的细菌细胞均有可能进一步发展 为球状矿物（李福春等，2011） 。然而，在没有微 生物参与但存在有机大分子的模拟实验中也发现 了球状碳酸盐矿物 （Zhou et al., 2010; 官叶斌等， 2010） 。因此，球状碳酸盐矿物的成因是远未解决 的科学问题，值得进一步研究。 本文试图通过为期140 d和165 d的细菌培养 实验和无菌对照实验，探讨细菌作用下球状碳酸 盐矿物形成的途径。 1材料与方法 1.1培养基的配制 培养基配制过程如下 （1）将KH2PO40.019 g， MgSO47 H2O 2.46 g，MgCl26 H2O 14.21 g，CaCl2 2 H2O 1.91 g，KCl 0.5 g，NH4Cl 0.25 g，酵母浸 膏 0.15 g，5060的乳酸钠溶液6 mL配制成溶 液并在 121℃下灭菌 20 min，冷却； （2） 将含有 Na2S9 H2O 0.5 g，NaHCO37.45 g的无菌溶液加入 溶液（1）中，定容至1 L； （3）在上述的1L 溶液中 加入1 mL 的FeCl24H2O（1.8 g/L）和0.5 mL生物 素（10.0 mg/ 100.0 mL） ； （4） 用1 mol/L的盐酸调 节上述混合溶液的pH值至7.5。依此方法制成的液 体培养基用于成矿实验。在该液体培养基中加入 2的琼脂可制成固体培养基，用于菌株的活化。 1.2菌株的基本特征 GW-M 为 本 实 验 室 保 存 的 柠 檬 酸 杆 菌 属 （Citrobacter sp.）的菌株。其基本特征为菌体呈 杆状，大小为1.01.2 2.25.3 μm，革兰氏阳 性，兼性厌氧（Guo et al., 2013） 。 1.3培养实验方法 用接种环挑取活化后成熟的GW-M菌落，分别 接种于两个装有100 mL已灭菌培养基的小盐水瓶 中，充N2并于30℃条件下进行恒温静置培养，分 别在培养至140 d和165 d时结束实验。同时设置 无菌实验作为对照。 1.4沉淀物的观察和测定方法 培养实验结束后用离心法将固相和液相分 离。用去离子水将固相产物反复清洗，并用离心 法将其收集，其目的是去除菌体和细菌分泌物。 使用万分之一天平称量并用差减法获得沉淀物质 量。将沉淀物磨细、涂片并自然风干，然后利用 D/max-B 型 X-射线衍射仪 （XRD） 测定其矿物成 分。测定条件为铜靶Kα，管压35kV，管流20mA， 22θ/min，步长0.022θ，测定范围10602θ。 2结果与分析 2.1沉淀物的质量 在第140 d和第165 d，实验组和无菌对照组的 盐水瓶底部均可观察到沉淀物。GW-M菌株作用下 形成的沉淀物质量均明显多于对照实验 （图1） 。 这充分说明GW-M菌株具有促进碳酸盐矿物形成的 能力。与第140 d相比，第165 d时实验组和对照 组的沉淀物质量均无明显的增加（图1） 。 2.2矿物种类 XRD测定结果表明，在第140 d时，无论是实 验组还是对照组，沉淀物均为单水碳钙石 （图 2） 。当实验进行到第165 d时，实验组的沉淀物以 方解石为主，含少量的单水碳钙石（图2a） 。对照 实验的沉淀物仍以单水碳钙石为主，仅有少量方 解石存在（图2b） 。 2.3矿物形态 从SEM照片可以看出，第140 d时，在柠檬酸 杆菌作用下形成的沉淀物形态较为多样，主要有 哑铃形、十字花形以及球状等（图3a-f） 。研究表 604 4 期郭文文等细菌作用下球状碳酸盐矿物形成的新途径以柠檬酸杆菌GW-M菌株为例 明，菌体可作为成核模板促进碳酸盐矿物的形成 （Schultze-Lam et al., 1996; Warthmann et al., 2000; 李 福春等, 2011） 。在微生物培养体系中，同时存在 着处于不同生长阶段的细菌细胞，而新生的菌体 可能成为新的成核模板。因此，多种矿物形态共 存可能与培养基中存在不同世代的细菌细胞有 关，即同一时期的实验产物中可观察到处于不同 发展阶段的矿物形态。作者根据图3 af推测，矿 物的形态可能经历了如下的演化过程单个哑铃 （图3a）→两端优先生长→球（图3b） ；两个交叉 的哑铃（图3c）→两个哑铃的两端各自优先生长 →球（图3d） ；三个交叉的哑铃（图3e）→三个哑 铃的两端各自优先生长→球 （图 3f） 。第 165 d 时，形成的矿物形态主要为类球状和板状 （图 3g） 。与 GW-M 菌株作用下形成的碳酸盐矿物相 比，无菌对照实验中形成的矿物形态较为单一 （图3h） ，主要为不规则状和哑铃形。 3讨论 以往对微生物作用下碳酸盐矿物形成过程的 认识主要是建立在短期培养基础之上的（马恒等, GW-MCK 140d165d 
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0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 图1GW-M菌株实验和无菌对照实验过程中形成 沉淀物质量的柱状图 Fig. 1Histogram of precipitate amount in the biotic and abiotic experiments 10 20 30 40 50 60 165 d 140d 2θ a MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC C MHC C C C C 10 20 30 40 50 60 2θ 165 d 140d b C MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC MHC单水碳钙石（monohydrocalcite） C方解石（calcite） 图2GW-M菌株实验（a）和无菌对照实验（b）过程中形成沉淀物的XRD图谱 Fig. 2X-ray diffractographs of precipitate in the biotic and abiotic experiments 605 高校地质学报2 1 卷 4 期 a e g c b f h d a-f 培养时间均为140 d. 其中 a 单个的哑铃形矿物; b 单个哑铃两端继续生长后的饱满状; c两个哑铃构成的“十字花”形矿物; d“十字花”形 矿物继续生长后的形态; e 三个交叉的哑铃; f 三个交叉的哑铃在一起继续生长的形态; g 培养时间为165 d 多个接近球形的矿物聚集而成的集合体 和板状矿物; h 培养时间为140 d的对照 哑铃形矿物和不规则的矿物集合体 a-f, culture time was the 140-th day. a the single dumbbell-shaped minerals; b the full shape of single dumbbell-shaped minerals with fine crystals gathered faster on both ends than the middle part of the dumbbell; c crisscross minerals which made up of two dumbbell-shaped; d the shape was the result of crisscross minerals continued growth; e three crossed dumbbell-shaped minerals; f the shape was the result of three crossed dumbbell-shaped minerals continued growth; g culture time was the 165-th day. The aggregate which made up of many close spherical minerals and rhombohedra-shaped minerals; h control experiments with a duration of 140days. The aggregate with dumbbell-shaped and irregular minerals 图3GW-M菌株实验和无菌对照实验过程中形成沉淀物的SEM照片 Fig. 3Scanning electron microscope images of precipitate in the biotic and abiotic experiments 2009; Sanchez-Romn et al., 2011; 李福春等, 2011; Guo et al., 2013） 。本文利用柠檬酸杆菌（GW-M菌 株）进行了时间较长（165 d）的培养实验。实验 结果表明，无论是实验组还是无菌对照组，实验 进行到第140 d时，沉淀物均为单水碳钙石。单水 碳钙石是碳酸钙的一种亚稳定形式，它在自然界 中较为少见。有关单水碳钙石在实验室被合成的 首例报道见于1950年（Dejehet et al., 1999） 。在自 然条件下，单水碳钙石倾向于在富镁 （高Mg/Ca 比） 的海水中形成 （ Taylor, 1975; Dejehet et al., 1999 ） 。Nishiyama等（ 2013 ）在CaCl2-MgCl2-Na2CO3 的纯化学体系中发现，尽管Mg2不进入单水碳钙 石的晶格，但是Mg2在其形成过程中是不可或缺 的。在存在微生物的实验体系中，也有关于发现 606 4 期郭文文等细菌作用下球状碳酸盐矿物形成的新途径以柠檬酸杆菌GW-M菌株为例 单水碳钙石的报道 （Rivadeneyra et al., 1998; 马恒 等, 2009） 。作为亚稳定形式的碳酸钙，单水碳钙 石通常会转变成稳定态的方解石。然而，单水碳 钙石却在本文的长期培养实验产物中作为主要矿 物类型而出现，其原因目前尚无法解释。 近些年来，球状结构的碳酸盐矿物引起越来 越多研究者的关注。一些研究者认为，在有细菌 参与的实验中，球状碳酸盐矿物是由许多微晶在 细菌细胞的两端聚集变大成为卵形 （即哑铃形） 再进一步生长、两端逐渐连接起来而成（ Warthmann et al., 2000; 李福春等，2011） 。细菌细胞两端优先 生长矿物的原因可能是与细胞中间部位相比， 两端带有更多的负电基团（Warthmann et al., 2000; Frankel and Bazylinski, 2003） ，因而更易聚集阳离 子；阳离子作为“阳离子桥”吸引CO32-，使细胞 两端的纳米晶体聚集更快 （李福春等, 2011） 。李 福春等在观察梭菌SN-1菌株诱导形成的碳酸盐矿 物形态的基础上推测，纳米晶体不仅可以在单个 细菌细胞的两端聚集成哑铃形矿物并最终演变为 球状矿物，而且还可以以两个垂直的细菌细胞为 模板发展为球状矿物 （李福春等, 2011） 。本文的 SEM照片 （图3a-f） 说明，除了上述两条途径可 以形成球状矿物以外，还有可能存在第三条途径 若三个交叉叠置的细胞两端各自优先生长，则 也有可能最终形成球状矿物。 4结论 作者利用从土壤中分离到的一株柠檬酸杆菌 （GW-M菌株）进行了长期的培养实验，利用SEM 和XRD对其固相产物的形态和种类进行了的观察 和测定，根据以上实验结果和讨论，可得到如下 几点初步结论 在柠檬酸杆菌（GW-M菌株）培养实验和无菌 对照实验中均有沉淀物生成，但后者的质量明显 少于前者。这说明GW-M菌株对碳酸盐矿物的形成 具有一定的促进作用。 在上文介绍的实验条件下，所形成的碳酸盐 矿物主要为单水碳钙石和方解石。 在GW-M菌株作用下形成的碳酸盐矿物具有多 种形态，包括哑铃形、十字花形以及球状等，而 对照实验中的碳酸盐矿物形态较前者单一，主要 为长柱状和少量哑铃形。作者推测，文中所见球 状矿物的形成途径可能有三条单个哑铃→两端 生长→球；两个交叉的哑铃→两个哑铃的两端各 自生长→球；三个交叉的哑铃→三个哑铃的两端 各自生长→球。 参考文献 （References ） 官叶斌，姚奇志，周根陶. 2010. 碳酸钙仿生矿化研究 多羧基有机分子 的影响[J]. 矿物学报，S1 219-210. 李福春，马恒，苏宁，等. 2011. 梭菌对含镁方解石形态的控制及其可 能机理[J]. 高校地质学报，17 1 13-20. 王红梅，吴晓萍，邱轩，等. 2013. 微生物成因的碳酸盐矿物研究进展 [J]. 微生物学通报，40 1 180-189. 马恒，李福春，苏宁，等. 2009. Citrobacter freundii作用下球形碳酸盐 矿物的形态演化过程研究[J]. 高校地质学报，15 3 429-436. Boquet E, Boronat A and Ramos-Cormenzana A. 1973. Production of calcite calcium carbonate crystals by soil bacteria is a general phenomenon [J]. Nature, 246 5434 527-529. Dejehet F, Idrissi S and Debuyst R. 1999. Magnesium and occluded water in calcium carbonate monohydrate [J]. The Journal of Chemical Physics, 96 741-753. Frankel R B and Bazylinski D A. 2003. Biologically induced mineralization by bacteria [J]. Reviews in Mineralogy and Geochemistry, 54 95-114. Guo W W, Ma H, Li F C, et al. 2013.Citrobactersp. strain GW-M mediates the coexistence of carbonate minerals with various morphologies [J]. Geomicrobiology Journal, 30 749-757. Mastandrea A, Perri E, Russo F, et al. 2006. Microbial primary dolomite from a Norian carbonate plat northern Calabria, southern Italy [J]. Sedimentology, 53 3 465-480. Nishiyama R, Munemoto T and Fukushi K. 2013. ation condition of monohydrocalcite from CaCl2-MgCl2- Na2CO3solutions [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 100 217-231. Rivadeneyra M A, Delgado G, Ramos-Corm enzana A, et al. 1998. Biomineralization of carbonates by Halomonas eurihalina in solid and liquid media with different salinities Crystal at ion sequence [J]. Res. Microbial. , 149 4 27- 287. Rodriguez-Navarro C, Jimenez-Lopez C, Rodriguez-Navarro A, et al. 2007. Bacterially mediated mineralization of vaterite [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 71 1197-1213. Sanchez-Romn M, Romanek C S, Fernndez-Remolar D C, et al. 2011. Aerobic biomineralization of Mg-rich carbonates Implications for natural environments [J]. Chemical Geology, 281 3-4 143-150. Schultze-Lam S, Fortin D, Davis B S, et al. 1996. Mineralization of bacterial surfaces [J]. Chemical Geology, 132 171-181. Taylor G F. 1975. The occurrence of monohydrocalcite in two small lakes in the south-east of South Australia [J]. American Mineralogist, 60 690-697. Warthmann R, Van Lith Y, Vasconcelos C, et al. 2000. Bacterially induced dolomite precipitation in anoxic culture experiments [J]. Geology, 28 1091-1094. Wright D T and Oren A. 2005. Nonphotosynthetic bacteria and the ation of carbonates and evaporites through time [J]. Geomicrobiology Journal, 22 27-53. Zhou G T, Guan Y B, Yao Q Z, et al. 2010. Biomimetic mineralization of prismatic calcite mesocrystals Relevance to biomineralization [J]. Chemical Geology, 279 63-72. 607