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一株芽孢杆菌对含砷矿物中砷的还原作用 邓博環 1， 2 许丽英 1* 王玉龙 1， 2 王新 1 贾永峰 1 1中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室，沈阳 110016;2中国科学院大学，北京 100049 摘要在自然环境中， 砷通常吸附于铁氧化物、 铝氧化物等金属氧化物矿物上， 或与这些 氧化物矿物形成共沉淀。厌氧条件下， 微生物可能通过直接还原砷或者还原铁氧化物等载 砷矿物从而影响砷的迁移转化。本研究筛选得到芽孢杆菌属的一株细菌 DX- 04， 并研究了 该菌株对不同形态砷酸盐的还原作用和还原途径。厌氧条件下， 在 12～24 h 内菌株 DX- 04 对溶解态砷的还原能力最强， 溶解态砷对提高细菌生物量具有明显的促进作用。接种菌株 DX- 04 的铁砷共沉淀培养基中液相 As III 浓度呈先升高后降低的趋势， 砷发生还原与释 放， 进而发生二次沉淀再次被固持。当以载砷氧化铝矿物为载砷的模型矿物时， 在 DX- 04 菌株的还原作用下， 吸附的 As V 首先从氢氧化铝矿物上释放到液相， 进一步被还原为 As III 。微生物的这一作用能够引起含砷矿物中的砷向水体、 沉积物环境中释放， 成为人 类健康的潜在威胁。 关键词砷;芽孢杆菌;微生物砷还原;铁砷共沉淀;氢氧化铝 Ｒeduction of arsenic in arsenic bearing minerals by a Bacillus strain． DENG Bo- huan1， 2， XU Li- ying1*，WANG Yu- long1， 2，WANG Xin1，JIA Yong- feng1 1Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering，Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sci- ences，Shenyang 110016，China;2University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049， China ． AbstractIn natural environment，arsenic is usually adsorbed on iron oxide，aluminum oxide and other oxide minerals，or ed co- precipitation with these oxide minerals． Microorganisms can reduce arsenate directly or reduce As- bearing iron oxides and other arsenic bearing minerals under anaerobic condition，which could influence the transation of arsenic． In this study，a bacteria strain was screened and identified as Bacillus sp． strain DX- 04 ，and the reduction be- havior and pathway of the strain on different speciations of the arsenic was studied． Under anaero- bic conditions，reduction rate of arsenate with the strain DX- 04 was highest in 12－24 h． Arsenate in the medium promoted the growth of the strain DX- 04． In the liquid medium inoculated with strain DX- 04 and Fe- As co- precipitation， the concentration of dissolved As IIIshowed the trend of increase at first and decrease several hours later． Arsenic reduction and release occurred，and then the second precipitation was ed． Under the reduction of the strain DX- 04，the As V adsorbed on aluminum hydroxide minerals released into the liquid phase，and then the dissolved As Vwas reduced． The role of microorganisms can cause the release of arsenic from arsenic bearing minerals into water and sediment environment，which becomes a potential threat to hu- man health． Key wordsarsenic;Bacillus;microbial arsenic reduction;Fe- As co- precipitation;aluminum hydroxide． 国家自然科学基金项目 41273133 资助。 收稿日期2016- 05- 03接受日期2016- 09- 02 * 通讯作者 E- mailxuliying iae．ac．cn 砷是一种重要的环境污染物， 其来源包括自然 来源和人为来源两种 肖细元等， 2008; Fitzmaurice et al．， 2009 。自然环境中， 砷通常以五价、 三价、 零 价、 负三价这几种价态存在 Cullen et al．， 1989 。 不同的化学形态的砷呈现不同的毒性， 一般情况下， As III 的毒性和迁移能力较 As V 更强 李慧等， 生态学杂志 Chinese Journal of Ecology2016， 35 12 3374－3381DOI10．13292/j．1000－4890．201612．010 2000 。砷在环境中迁移转化过程受到 Eh- pH、 水合 金属氧化物、 有机质、 微生物作用等多种因素的影响 Ahmann et al．， 1997 。生物在砷的迁移、 转化过程 中起着十分关键的作用 Oremland et al．， 2000 。微 生物作用下可造成天然水土环境中的砷在不同形态 之间的相互转化， 从而影响环境中砷的迁移性和生 物有效性 James et al．， 2005 。尤其是厌氧环境中， 砷还原菌能通过还原作用将 As V 还原为As III ， 引起吸附态 As 和矿物结合态 As 向水体中的释放， 进而引发环境污染的问题。 一般认为， 微生物砷酸盐还原方式主要包括耐 砷微生物的细胞质砷还原作用以及异化砷还原菌的 呼吸性砷还原， 也称为异化砷还原作用 Oremland et al．， 2000， 2005 。细胞质砷还原是一种重要的微 生物砷解毒机制。该机制由 ars 操纵子编码的一系 列酶共同协作， 先将进入细胞质内的 As V 还原为 As III ， 再通过运载蛋白将 As III 泵出细胞， 降低 细胞内砷浓度从而达到对细胞解毒的作用。异化砷 还原作用是指利用乳酸盐、 乙酸盐等小分子有机物 为电子供体， 以 As III 作为电子受体进行的砷还原 作用， 已经发现的具有异化砷还原能力的微生物包 括 γ- 、 δ- 、 ε- 变形菌， 低 GC 含量革兰氏阳性菌等在 内的多种细菌及某些真菌 Mukhopadhyay et al．， 2002 。同时， 细菌胞外聚合物也可参与砷的还原 过程， Babechuk 等 2009利 用 Shewanella 菌 株 ANA- 3 研究微生物砷酸亚铁的还原过程发现细菌 胞外聚合物上也聚集有砷的还原产物， 推测细菌胞 外聚合物参与了砷的还原过程， 而细胞色素 c 进行 胞外还原可能也是 Shewanella 菌株 ANA- 3 的砷还 原方式之一。 微生物能通过与固砷矿物的相互作用影响砷的 生物地球化学循环 Fan et al．， 2014 。异化铁还原 菌能够将铁氧化物中的 Fe III 还原为 Fe II 引起 吸附态 As V 的释放， 进而可能被异化砷还原菌或 耐砷微生物还原为 As III Islam et al．， 2004; Salas et al．， 2010; 王兆苏等， 2010; Zhang et al．， 2012 。砷 还原菌在这一循环中的作用是通过影响铁的存在形 态而间接实现的。在砷还原菌对臭葱石的还原研究 发现， 几种砷还原菌均表达并分泌了铁载体， 铁载体 与 Fe III 结合， 使 As V 从矿物上游离出来后再被 微生物还原 Drewniak et al．， 2008 。总之， 不同种 微生物对含砷矿物的作用不同， 也存在不同类型的 砷还原机理， 微生物还原作用下砷在环境中的形态 与行为表现的更加复杂。 锦州湾是我国典型的重金属污染区域， 其中在 河流排污口处取得的沉积物样品中砷的含量经过测 定为 2876．02 mgkg －1 。本研究针对锦州湾高砷污 染沉积物中的砷还原菌进行分离筛选， 获得一株芽 孢杆菌， 初步研究该菌株对溶解态砷酸盐， 砷铁共沉 淀以及铝氧化物吸附态砷酸盐的还原与转化行为， 并初步探讨砷还原途径， 以期为砷的环境地球化学 行为机理研究提供一定理论与数据支持。 1材料与方法 1. 1培养基的配制 基础盐培养基 MSM gL －1 的配制 KH2PO4， 0．14; NH4Cl， 0．25; KCl， 0．5; NaCl， 1．0; CaCl22H2O， 0．13; MgCl2xH2O， 0．62; NH4 2SO4， 0．5; 乳酸钠， 2．0 molL －1 ; 31 gL －1 As V 储备液。用 0．1 和 1 molL －1 NaOH 调节 pH 为 6．8 至 7．2。培养基采 用无氧水配制， 配制过程在厌氧箱中进行， 配置完成 后于 1．05 kgcm －2 ， 121 ℃ 条件下高温蒸汽灭菌 20 min。 1. 2微生物的分离、 筛选和鉴定 采用锦州湾地区的河流交汇处及排污口所采得 的沉积物样品作为细菌来源。微生物的富集过程中 参照张雪霞 2009 的方法进行， 经过富集筛选得到 了厌氧条件下具有稳定的砷还原能力的菌群。砷还 原菌的单个菌株筛选采用亨盖特滚管法进行， 菌落 中的单个菌落即为具有砷还原能力的菌群中的纯菌 种。配制固体培养基， 接种后， 35 ℃培养 48 h， 观察 菌落形态， 并在光学显微镜下观察细菌的形态。 微生物的 16S rDNA 鉴定由生工生物工程 上 海 股份有限公司进行。将测序后得到的 16S rDNA 序列在 NCBI 的细菌核糖体数据库上进行 Blast 比 对， 得到菌种的分类学信息。 1. 3菌株 DX- 04 对培养基中液相砷的还原 为研究筛选得到的菌株在含砷培养基中的生长 状况和砷还原能力， 在厌氧条件下分别配制无砷基 础盐培养基和 As V 浓度为 75 mgL －1 的含砷培 养基， 调节培养基的 pH 至 7．2。磁力搅拌条件下取 20 mL 厌氧分装到 50 mL 厌氧瓶中， 后于 121 ℃、 1．05 kgcm －2 条件下灭菌 20 min。放置冷却后在无 菌条件下以 4的接种量接种菌液， 所接种细胞的 浓度大约为 2．11106cellsmL －1 ， 并以接种无菌培 养基的培养瓶对照组， 每组设置 3 个平行。接种后 5733邓博環等 一株芽孢杆菌对含砷矿物中砷的还原作用 样品 与 对 照 组 样 品 放 入 培 养 箱 中 35 ℃、 170 rmin －1 恒温振荡培养， 于不同的培养时间进行 取样。 在异化砷还原作用中， As V 作为电子受体， 其 含量对于异化砷还原菌的生长和还原情况具有重要 的影响， 在耐砷微生物生长过程中， 由于微生物对砷 的耐受程度的不同， 其生长情况会受到砷浓度的影 响。因此设置了不同砷含量下微生物的生长和还原 实验， 研究 As V 浓度对菌株 DX- 04 的生长还原的 影响。配制砷酸盐含量分别为 0、 10、 25、 75 mgL －1 的基础盐培养基， 以接种无菌培养基的培养瓶对照 组， 每组设置 3 个平行， 121 ℃灭菌 20 min， 放置冷 却后以 4的接种量接种， 培养并取样测定。 1. 4菌株 DX- 04 对含砷矿物的还原 自然环境中砷通常以吸附态形式存在， 本实验 分别以铁砷共沉淀、 载砷氢氧化铝作为含砷矿物的 代表， 通过不同的接种方式， 接种不同的细胞成分， 研究菌株 DX- 04 对含砷矿物的作用。在实验过程 中为避免硫酸根的存在对含砷矿物的影响， 培养基 中 NH4 2SO4的用量减少为 0．05 gL －1 ， NH4Cl 的 用量增加为 0．7 gL －1 。实验过程在厌氧无菌条件 下操作， 以无菌培养基作为对照每组培养基设置 3 个平行。 铁砷共沉淀的还原 根据吕洪涛等 2008 的方 法， 在 pH7 条件下， 合成铁砷摩尔比为 8 的 Fe- As 共沉淀。将 pH7 的 FeCl3和砷酸钠储备液在磁力 搅拌下混合均匀。将混合物离心清洗 3 次之后冷冻 干燥。经测定其中砷含量为 25 mgg －1 。取共沉淀 3．6 g 添加 45 mL 去离子水混匀。配置 pH 7．2 的 无机氮源基础盐培养基， 分装至50 mL 厌氧瓶中， 每 瓶厌氧瓶中添加 0．5 mL 的 Fe- As 共沉淀悬浊液及 19．5 mL 的 培 养 基， 使 培 养 基 中 As 浓 度 为 50 mgL －1 ， 用 0．1 molL －1 的 NaOH 调节 pH 至 6．8～ 7．2。分装好的厌氧瓶灭菌 20 min。放置至室温时 进行接种。接种砷还原菌菌株 DX- 04 并设置空白 对照组培养基接种一段时间后取样测定。 氢氧化铝吸附态的还原 磁力搅拌条件下， 向 1 molL －1 的 AlCl36H2O 溶液中缓慢加入等体积 的 3 molL －1 NaOH， 用 0．1 molL －1 的 NaOH 和 HCl 溶液调节混合液 pH 到 7， 平衡 24 h 后冷藏备 用。磁力搅拌下， 以铝砷摩尔比为 10， 将 pH 7 的砷 酸盐 储 备 液 缓 慢 加 入 氢 氧 化 铝 悬 浊 液 中， 用 1 molL －1 NaOH 和 HCl 调节混合液 pH 到7。室温 下， 吸附24 h后， 将吸附了 As V 的氢氧化铝悬浊液 离心弃掉上清液， 再加入去离子水进行重新悬浮， 清 洗 3 次后冷冻干燥。经测定氢氧化铝矿物吸附砷的 量为94．29 mgg －1 。厌氧条件下， 配置基础盐培养 基， 使培养基中的 As T 浓度约为 10 mgL －1， 调节 pH 至 7．2， 分装至厌氧瓶中并灭菌。无菌操作下， 将 接种 48 h 后的无砷基础盐培养基中的菌液经 0．22 μm 滤膜过滤， 得到无菌的培养液。以灭菌后的培 养基为空白对照， 生物培养组培养基中分别接种含 菌培养液， 无菌培养液， 添加了 NaN3的无生命活性 的菌液 接种后的培养基中 NaN3浓度为 2 ， 培养 一段时间后取样。 1. 5分析方法 液相三价砷 As III 及液相总砷 As T 浓 度的测定采用氢化物发生- 原子荧光光谱法， 以硼氢 化钾为还原剂进行测定。As T 的测定以硫脲及抗 坏血酸为预还原剂， 将液相 As V 还原为 As III 再进行测定。液相二价铁 Fe II 浓度采用邻菲 罗啉 方 法 在 510 nm 下 进 行 测 定。液 相 总 铁 Fe T 浓度的测定采用原子吸收方法进行。采用 紫外分光光度法测定菌悬液的 600 nm 下的吸光度 OD600， 以表示培养液中的菌体浓度。 2结果与分析 2. 1微生物的分离筛选与鉴定 通过分离筛选， 得到了一株能够在厌氧条件下 生长的具有砷还原能力的细菌 DX- 04， 该细菌为兼 性厌氧菌， 菌落呈乳白色至淡黄色， 表面湿润， 菌落 扁平。在光学显微镜下单个菌体细菌呈现短杆状。 利用 16S rDNA 技术进行 PCＲ 扩增， 电泳结果可以 确定克隆的序列大小约为 2000 bp。进而测序得到 细菌的 16S rDNA 序列信息， 在 GeneBank 中进行序 列比对， 确定该细菌为芽孢杆菌属的一株细菌。 2. 2砷还原菌对培养基中液相砷的还原 2. 2. 1菌株 DX- 04 生长以及菌体对砷的还原作用 如图 1 所示， 在接种 6 h 后 DX- 04 开始进入快速 增长期， 在 6～24 h 内菌株 DX- 04 的生物量增加最 快。随着菌体生物量的增加， 培养基中 As III 浓度 也增加， 未接种 DX- 04 的培养基中 As III 浓度没 有明显的增加， 因此可以确定菌株 DX- 04 的生长代 谢是引起 As V 还原为 As III 的主要原因。菌株 DX- 04 的还原效率在 12 h 左右最高， 为 0． 221 mgL －1 h －1 ， 随后降低， 菌株DX-04在培养时间 6733生态学杂志第 35 卷第 12 期 图 1菌株 DX- 04 在培养基中的生长 A 以及对 As V 的 还原作用 B Fig．1The growth curve Aand As Vreducing effect Bby the strain DX- 04 0～480 h 内始终具有一定的砷还原能力。 2. 2. 2不同砷酸盐浓度条件下 DX- 04 的生长情况 DX- 04 菌株对砷酸盐具有较强的还原作用， 作为 电子受体， 同时也是毒性物质， 所投加的砷酸盐的浓 度也会影响菌株的生长状况。本研究设置不同初始 砷酸盐浓度进行菌株培养， 以测定细菌生长量来考 察砷酸盐浓度对菌株 DX- 04 生长过程的影响。菌 株 DX- 04 在不同砷酸盐浓度培养基中的生长情况 表明 图 2 ， 整个培养过程中， 菌株 DX- 04 的生物量 持续迅速增加， 培养 72～96 h 期间出现明显的二次 快速增长期而后菌体生物量增加速度变缓。 在培养 图 2不同砷浓度下菌株 DX- 04 的生长曲线 Fig．2The growth curve of the strain DX- 04 in the medium with different arsenate concentrations 时间为 0～96 h 内， 培养基中的生物量与无砷培养 组相差不大， 砷对菌株的生物量没有明显的影响。 在随后的培养过程中， 含砷培养基中所得的生物量 高于无砷培养组的生物量。含砷培养组所得的生物 量整体高于无砷培养组， 尤其是 As V 初始浓度为 75 mgL －1 的培养组， 累积的生物量和增长速度明 显高于其他几个培养组。可见， 在实验浓度范围内 没有表现出砷对细胞生长的抑制作用， 而且加入的 砷酸盐可明显促进菌株 DX- 04 的生长。 2. 2. 3菌株 DX- 04 对砷酸盐的还原作用不同含 量的砷酸盐培养组中， DX- 04 还原产生的 As III 浓 度变化如图 3A 所示， 培养基中的 As III 浓度在接 种 6 h 后即快速增加; 当培养时间在 24～72 h， 随着 培养时间的增加培养基内积累的 As III 浓度而逐 渐升高， 尤其是 As V 为 75 mgL －1 的培养组产生 积累的 As III 的浓度最高， 增长迅速， 培养结束时 培养液中 AS III 的量相当于总砷量的 8。而 As V 初始浓度为 10 和 25 mgL －1 的培养组中， 产 生 As III 相对较少， 其中还原转化的亚砷酸盐分别 占总砷的 5和 6。 对菌株 DX- 04 的砷还原效率进行分析， 其结果 如图3B 所示。在砷酸盐含量不同的3 组培养基中， 图 3菌株 DX- 04 作用下不同的砷酸盐含量的培养基中液 相 As III 浓度 A 、 砷还原速率 B Fig．3Concentration of dissolved As III Aand reduc- tion rate of As V Bin the medium with different con- centrations of As Tinoculated with the strain DX- 04 7733邓博環等 一株芽孢杆菌对含砷矿物中砷的还原作用 砷还原菌的还原效率均在 12 h 达到最大， 随后降 低。当培养时间延长到约 96 h 时， 无论是加入 25 mgL －1 还是 75 mgL －1 的培养组在 96 h 时砷酸盐 还原速率都出现明显的二次高峰， 而这一时刻也是 DX- 04 菌体细胞积累的二次高峰的时刻。可见， 砷 酸还原速率与细胞的生长过程保持一致。 2. 3菌株 DX- 04 对含砷矿物的还原 2. 3. 1菌株 DX- 04 对铁砷共沉淀的还原作用研 究表明， 微生物细胞对砷的还原途径包括异化砷还 原、 细胞解毒以及细胞外还原等几种不同途径。本 研究为了考察 DX- 04 菌体细胞对砷的还原能力， 设 定了接种菌株 DX- 04 的培养基与空白对照， 研究菌 株对砷的还原机理。 培养基中液相 As III 的浓度变化如图 4A 所 示。接种了菌株 DX- 04 的培养基中液相 As III 的 浓度呈现先升高后降低的趋势， 培养时间为 48 h， 液 图 4菌株 DX- 04 对铁砷共沉淀作用下培养基中液相 As III 浓度 A 、 总砷浓度 As T B 以及液相 Fe II 浓度 C 的变化 Fig．4Concentration of dissolved As III A ，dissolved As T Band dissolved Fe II Cin the medium inoc- ulated with the strain DX- 04 相中积累的 As III 浓度最大， 为 0．51 mgL －1。随 后液相 As III 的浓度迅速降低。在培养过程中在 空白对照组液相也出现了一定量的 As III ， 可能与 培养基中乳酸钠， 酵母粉等物质的化学作用有关。 图 4B 显示， 体系添加总砷含量为 50 mgL －1 ， 在菌株 DX- 04 培养组中， 总砷释放量约为 4． 4 mgL －1 。可以看出， 被还原的砷酸盐占所释放砷的 11．3， 大部分砷仍然以砷酸盐形态存在。在空白 对照中， 也出现一定程度的砷释放与还原， 这与培养 基中乳酸盐的解吸作用及培养基中还原性物质的作 用有关。说明菌株 DX- 04 能通过以上一种或几种 作用对 Fe- As 共沉淀中的 As V 进行解吸、 还原， 导 致砷的释放， 影响砷在环境中的赋存形态。 本研究发现， DX- 04 也具有铁还原能力， 实验中 也发现菌株 DX- 04 对铁砷共沉淀的还原性溶解作 用。在不同的处理下， 添加了 Fe- As 共沉淀的培养 基中溶解态 Fe II 的浓度变化如图 4C 所示， 培养 12 h 体系中已经出现铁还原， 液相积累的亚铁离子 浓度出现迅速升高， 尤其 72～96 h 期间释放的速率 最快， 同时砷还原与释放过程也在快速进行， 说明铁 还原与砷还原保持相同趋势。可见， DX- 04 对砷铁 共沉淀的稳定性影响包括直接还原砷， 同时也还原 固砷的铁矿物基质， 通过改变固砷的矿物结构影响 砷的稳定性。 2. 3. 2菌株 DX- 04 对培养基中的吸附在氢氧化铝 上的 As V 还原在天然水土沉积物环境中， 铝的 氢氧化物或氧化物矿物对砷的固持也具有重要的贡 献， 因此本研究选用微生物不可还原的氢氧化铝为 载砷基质， 负载砷， 研究 DX- 04 的砷还原作用下氢 氧化铝吸持态的砷的稳定性的影响变化对砷形态的 影响。 研究采用乳酸钠作为电子供体， 乳酸钠分子上 的羧酸根对铝基吸附的砷具有解吸附作用， 因此空 白对照中， 培养液中游离的砷酸盐背景比较高 图 5B 。生物处理组中的液相 As T 浓度均呈现先增 加后降低的趋势。As T 浓度在接种后快速增加， 在培养 12 h 左右的液相 As T 浓度最大， 随后降 低， 在培养 24 h 后液相 As T 浓度基本稳定。而对 照组中， 液相 As T 浓度在培养 24 h 左右达到最 大， 随后液相 As T 浓度基本保持平衡。培养结束 时， 空白对照中释放的总砷量为 1．20 mgL －1， 而在 接种了菌株 DX- 04、 无菌培养液以及失活细胞的 实验组中释放的总砷量分别为1．56、 1．65和1．59 8733生态学杂志第 35 卷第 12 期 图 5菌株 DX- 04 作用下氢氧化铝培养基中液相 As III 浓 度 A 和总砷浓度 As T B Fig．5Concentration of dissolved As III Aand dis- solved As T Bin the aluminum hydroxide medium in- oculated with the strain DX- 04 mgL －1 。可见， 接种了菌株 DX- 04、 无菌培养液或 者失去生命活性的细胞均能够加快氢氧化铝对 As T 的解吸过程及再吸附过程， 并且使液相 As T 浓度维持更高的水平。菌株 DX- 04 首先促进 了As T 从吸附在氢氧化铝矿物上释放到液相， 随 后对液相的 As V 进行还原。 DX- 04 的活动是导致砷的还原的主要因素。菌 株 DX- 04 对培养基中的载砷氢氧化铝的还原作用 如图 5A 所示， 随着微生物还原的进行， 接种了菌株 DX- 04 的培养基中 As III 增加。培养 72 h 后， 砷 还原速率迅速增加。至培养结束， 液相累积的 As III 达到 0．62 mgL －1 ， 液相中大约 39．8的 As V 被还原。而在接种了无菌培养液 空白对 照 及灭活细胞的培养基中， As III 浓度分别为 0．046和 0．042 mgL －1 。可见， 菌株 DX- 04 对砷的 还原依赖于细胞的生命活性。 3讨论 3. 1砷对 DX- 04 生长的促进作用 本研究筛选的芽孢杆菌属菌株 DX- 04 可以将 As V 还原为 As III ， 是一株砷还原菌。在不同浓 度的砷酸盐培养条件下， 微生物的菌体生长量与培 养基中 As III 浓度的增加具有一定的相关性。在 6～12、 72～96 h 内， 微生物的砷还原效率伴随着微 生物生物量快速增加， 而在无砷培养基中生物量的 增加相对较慢， 说明培养基中的砷酸盐的添加促进 了 DX- 04 的生长， 特别是在培养 72～96 h 时， 菌体 浊度出现二次增加， 砷酸盐的还原速率也出现二次 高峰。说明砷的存在的确促进了 DX- 04 的生长。 砷虽然具有生物毒性， 但许多研究都发现砷能够参 与微生物的新陈代谢过程。光能异养微生物外硫红 螺菌 属 Ectothiorhodospira菌 株 PHS- 1 能 够 以 As III 为唯一电子供体进行细胞的生长和代谢， As III 的存在能够促进菌株 PHS- 1 的生长; 异化砷 还原菌能够以 As V 作为电子受体进行能量代谢， 参与微生物的生长代谢过程 Budinoff et al．， 2008; Kulp et al．， 2008 。对于菌株 DX- 04， As V 对其生 长代谢的促进作用的生物学机理还需要进一步 研究。 3. 2砷还原菌对含砷矿物的还原 天然水土环境中铁铝的氧化物或氢氧化物是影 响砷的形态环境行为的重要矿物， 砷在环境中发生 的吸附与解吸， 氧化与还原， 沉淀与溶解等过程与这 些载砷矿物的形态和稳定性息息相关。微生物一方 面可以直接通过氧化还原改变砷的氧化形态而影响 砷的环境行为， 同时也可以通过改变载砷矿物基体 的形态而影响砷的稳定性 Zobrist et al．， 2000 。正 如 DX- 04 菌可以直接还原砷酸盐， 并且也能够还原 铁， 这样在铁砷共沉淀负载砷的还原与释放过程中， 砷可能有两个途径被还原 1 微生物对 Fe- As 共沉 淀中的 As V 进行还原， 造成了液相 As III 浓度 的升高; 2 微生物对 Fe- As 共沉淀中的 Fe III 进行 溶解性还原， 造成吸附的 As V 解吸附促使 As V 从矿物中解吸下来， 使得 As V 向液相释放， 而随 后微生物将液相中的 As V 还原为 As III 。 异化铁还原作用使 Fe III 还原为 Fe II ， 吸附 于铁氧化物上的 As III 释放出来， 一部分 Fe II 及 As III 再次吸附在铁氧化物表面， 另外一部分以溶 解态形式存在于液相中 Cummings et al．， 1999 。 当厌氧条件下， 微生物对负载砷的铁氧化物或 铁砷共沉淀进行异化铁、 砷还原时， 液相中能存在溶 解态的 As III 、 As V 、 Fe II ， 同时还能在矿物表 面再次吸附以及形成砷酸亚铁、 亚砷酸亚铁等次生 矿物 Dixit et al．， 2003 。也就是说， 液相 As III 及 Fe II 浓度达到一定水平时， 游离存在的亚铁离子 9733邓博環等 一株芽孢杆菌对含砷矿物中砷的还原作用 可以与所释放的砷酸盐或亚砷酸盐结合而沉淀， 形 成砷酸亚铁或者亚砷酸亚铁 Dixit et al．， 2003; Johnston et al．， 2007 。在用 Shewanella 菌株 ANA- 3 对砷酸亚铁的还原过程中， 也发现还原生成的 As III 和溶液中的 Fe II 能粘附于菌株 ANA- 3 的 胞外聚合物上， 形成亚砷酸亚铁颗粒 Babechuk et al．， 2009 。本研究中， DX- 04 对砷铁的还原过程 中培养后期液相积累的亚砷酸盐浓度出现二次降 低， 由于该过程伴随着亚铁离子的释放以及后期液 相积累的亚铁离子浓度出现降低， 形成砷酸亚铁或 者亚砷酸亚铁是 As III 出现二次降低的原因。 菌株 DX- 04 为含有荚膜及胞外聚合物的芽孢 杆菌属的微生物。而根据 Huang 等 2011a， 2011b 的研究， 微生物能够通过产生荚膜及胞外聚合物成 分 EPS ， 在培养基中直接接种 S． putrefaciens 菌株 CN- 32 或者从培养液中提取的 EPS 成分， 均能吸附 在针铁矿和 氢 氧化铝矿物上， 促使 As V 从矿物 上解吸下来。而在本实验的生物处理组中， 无论是 过滤后培养液中还是失去了活性的菌株 DX- 04 细 胞中， 均含有荚膜即胞外聚合物 EPS 成分， 这可能 造成了氢氧化铝矿物上吸附的 As V 的解吸。菌 株 DX- 04 首先使 As V 从氢氧化铝矿物吸附态解 吸下来， As V 释放到液相后， 对液相的 As V 进 行还原。而在接种了菌株 DX- 04 的 Fe- As 共沉淀培 养基中液相 As T 浓度不断变化， As III 的浓度呈 现先升高后降低的趋势， 砷发生还原与释放的过程， 进而发生二次沉淀再次被固持， 其形态应该为厌氧 条件下更加稳定的次生的含铁亚砷酸盐矿物。 与 Fe- As 共沉淀不同， 铝氧化物矿物很难被砷 还原菌 DX- 04 还原。在还原实验进行前， 培养基中 的 As T 主要来自于氢氧化铝矿物上吸附的砷的解 吸， 培养基中的 As III 主要来自于 As V 储备液 中含有的少量 As III 以及培养基中还原性物质对 As III 的氧化。在中性 pH 条件下， 铝氧化物矿物 对 As V 的吸附量较铁氧化物对 As V 的吸附量 低 Zhang et al．， 2012 。以氢氧化铝矿物吸附砷为 模型矿物研究时， 在 DX- 04 菌株的还原作用下， 吸 附的 As V 首先从氢氧化铝矿物上释放到液相， 吸 附态转为游离态， 造成培养基中液相 As T 浓度快 速增加， 并且 As T 的相对释放量 15．9 比铁氧 化物体系中更高 7．5 。As T 释放后由微生物 对液相的 As V 进行还原， 砷酸盐转化为亚砷 酸盐。 总之， 菌株 DX- 04 作为砷还原微生物， 厌氧条 件下在含有砷酸盐的培养基中能够更好的生长， 表 明砷酸盐虽然具有生物毒性， 但在缺乏其他电子受 体的情况下， 砷酸盐能够作为电子受体促进微生物 的生长。菌株 DX- 04 对含砷矿物的作用主要是通 过促进吸附态砷的解吸来进行的， 砷还原菌的这一 作用能够使吸附态的 As V 转化为溶解态， 进一步 被还原为毒性更强的 As III ， 引起砷向水体、 沉积 物环境中释放， 成为人类健康的潜在威胁。微生物 的砷还原与铁还原过程的同时进行， 能够促使厌氧 条件下更稳定的亚砷酸盐矿物的产生， 对砷的生物 地球化学过程具有重要意义。 参考文献 李慧，张立实． 2000． 砷的毒性与生物学功能． 现代预防医 学，27 1 39－40． 吕洪涛，贾永锋，闫洪，等． 2008． pH 值、 碱类型及预停留 时间对铁砷共沉淀物长期稳定性的影响． 生态学杂志， 27 9 1576－1579． 王兆苏，陈学萍，王新军，等． 2010． 水稻土中铁的厌氧生物 氧化还原循环对砷的影响． 生态毒理学报，5 6 862－ 867． 肖细元，陈同斌，廖晓勇，等． 2008． 中国主要含砷矿产资源 的区域分布与砷污染问题． 地理研究，27 1 201－ 212． 张雪霞，贾永锋，陈亮，等． 2009． 砷还原菌群对砷的还原 作用及菌群的多样性分析． 生态学杂志，28 1 64－ 69． Ahmann D，Krumholz LＲ，Hemond HF，et al． 1997． Microbial mobilization of asenic from sdiments of the Aberjona Water- shed． Environmental Science ＆ Technology，312923 － 2930． Babechuk MG，Weisener CG，Fryer BJ，