三种好氧细菌诱导碳酸钙矿物的形成.pdf

书书书第４９卷第６期２０１３年１１月南京大学学报（自然科学）ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＡＮＪＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＮＡＴＵＲＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ）Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２０１３＊基金项目国家自然科学基金（４１１７２３０８），中国科学院黄土与第四纪地质国家重点实验室开放课题（ＳＫＬＬＱＧ１３０９），中国科学院知识创新工程重大项目（ＫＺＺＤ－ＥＷ－０４），江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（ＣＸＺＺ１２－０２６９）收稿日期２０１３－０９－２０＊＊通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌｆｃｈｌｉ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ三种好氧细菌诱导碳酸钙矿物的形成＊李福春１＊＊，郭文文１，２（１．南京农业大学资环与环境科学学院，南京，２１００９５；２．枣庄学院，枣庄，２７７１６０）摘要研究微生物诱导碳酸盐矿物形成的能力对于理解碳酸盐的微生物矿化机理具有重要的意义．微生物参与下碳酸钙系列矿物的形成过程既与微生物本身的性质有关，而且还与物理化学条件密切相关．因而，实验条件相同是对不同微生物矿化能力开展对比研究的前提．目前，针对不同类型微生物的矿化能力而开展的对比研究工作还相当缺乏，相关的认识主要是基于各研究者根据微生物类型来确定实验条件（尤其是培养基成分）进而开展实验所获得的结果．为了对比研究不同微生物在促进碳酸盐矿物形成以及对所形成矿物种类和形态的影响，本文利用从同一土壤样品中分离得到的三种好氧细菌－蜡状芽孢杆菌（ＧＷ－１菌株）、赖氨酸芽孢杆菌（ＧＷ－２菌株）和微杆菌（ＧＷ－３菌株）在Ｂ４培养基中、在完全相同的条件下进行了为期４０ｄ的培养实验．测定了沉淀物重量、溶液的ｐＨ值和电导率，并利用ＳＥＭ和ＸＲＤ技术对矿物形态和组成进行了观察和测定．实验结果表明（１）三株细菌均具有诱导碳酸盐矿物形成的能力，其能力的大小顺序为ＧＷ－２菌株＞ＧＷ－１菌株＞ＧＷ－３菌株；（２）细菌死亡后的自溶过程使溶液ｐＨ值升高；（３）ＧＷ－１菌株和ＧＷ－２菌株作用下分别形成四方双锥状方解石和半球状方解石，而ＧＷ－３菌株则有利于形成球状球霰石．此外，文中还讨论了细菌促进碳酸盐矿物形成的主要过程，认为细菌在新陈代谢过程中将有机氮源转化为ＮＨ＋４和死亡细菌的自溶可能是导致溶液ｐＨ值升高并促进碳酸盐矿物沉淀的主要过程，细菌呼吸作用产生ＣＯ２及其后的化学过程可能是细菌将有机碳源转化为无机碳沉淀的重要途径．关键词蜡状芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌，微杆菌，方解石，球霰石，Ｂ４培养基ＴｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｄｕｃｅｄｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅＬｉＦｕ－Ｃｈｕｎ１，ＧｕｏＷｅｎ－Ｗｅｎ１，２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．ＺａｏｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚａｏｚｈｕａｎｇ，２７７１６０，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＳｔｕｄｙｉｎｇｏｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｃａｒｂｏｎａｔｅｈａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｒｂｏｎａｔｅｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｍｉｃｒｏｂｅ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｃａｌｃｉｕｍｃａｒ－ｂｏｎａｔｅｎｏｔｏｎｌｙｒｅｌａｔｅｓｔｏｔｈｅｇｅｎｉｕｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，ｂｕｔａｌｓｏｔｏｔｈｅｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｕｓ，ｔｈｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｆｏｒｃｏｎｔｒａｓｔｉｖｅｓｔｕｄｙｉｎｇｏｎｔｈｅｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｅｓｉｓｔｈａｔｔｈｅｓｅｔｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ南京大学学报（自然科学）第４９卷ｎｅｅｄｔｏｂｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｎｔｒａｓｔｉｖｅｗｏｒｋｓａｂｏｕｔｔｈｅａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｅｓｆｏｒｃａｒｂｏｎａｔｅｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｒｅｒａｒｅｉｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｋｎｏｗｌｅｄｇｅｍａｉｎｌｙｃｏｍｅｆｒｏｍｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎ－ｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｍｅｄｉｕｍ）ｗｈｉｃｈｗａｓｃｈｏｓｅｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｙｐｅ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｉｎｇｏｎｔｈｅｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅｍｉｎｅｒａｌｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ，ａｂａｔｃｈｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｗｉｔｈａｄｕｒａｔｉｏｎｏｆ４０ｄａｙｓｉｎＢ４ｍｅｄｉｕｍｕｎｄｅｒｔｈｅｍｅｄｉａ－ｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉａＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ（ｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－１），Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．（ｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－２）ａｎｄＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．（ｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－３）ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅｓｏｉｌ．Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ，ｐＨｖａｌｕｅａｎｄｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓｏｆｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｃａｒｂｏｎａｔｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｓｉｎｇｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉ－ｃｒｏｓｃｏｐｙ，ａｎｄｍｉｎｅｒａｌｓｐｅｃｉｅｓｏｆｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＸ－ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍａｉｎｌｙｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ（１）Ａｌｌｔｈｒｅｅｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓｍｉｇｈｔｉｎｄｕｃｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｏｆｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ，ｔｈｅｉｒｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓａｒｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＧＷ－２＞ＧＷ－１＞ＧＷ－３；（２）ＴｈｅａｕｔｏｌｙｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｃｅｌｌｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍ；（３）ＴｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－１ｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｔｅｗｉｔｈｓｑｕａｒｅｄｉｐｙｒａｍｉｄｓｈａｐｅ，ａｎｄｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－２ｉｎｄｕｃｅｄｈｅｍ－ｉｓｐｈｅｒｉｃａｌｃａｌｃｉｔｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－３ｍｅｄｉａｔｅｄｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｐｈｅｒｉｃａｌｖａｔｅｒｉｔｅ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｃａｒｂｏｎａｔｅａｌｓｏｗａｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｅｐａｐｅｒ．ＴｈｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｓｉｄｅｒｔｈａｔｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＮＨ＋４ｂｙｂａｃｔｅｒｉａｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｐｒｏｃｅｓｓａｎｄａｕｔｏｌｙｓｉｓｏｆｄｅａｄｂａｃｔｅｒｉａｍｉｇｈｔｂｅｔｈｅｍａｉｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｃａｕｓｉｎｇｐＨｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｄｃａｒｂｏｎａｔｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．ＴｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔａｐｐｒｏａｃｈｏｆｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｒｏｍｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｔｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｉｎｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｍｉｇｈｔａｔｔｒｉｂｕｔｅｔｏｔｈｅＣＯ２ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂｙｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎａｎｄｓｕｂｓｅ－ｑｕｅｎｔｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ；Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．；Ｃａｌｃｉｔｅ；Ｖａｔｅｒｉｔｅ；Ｂ４ｍｅｄｉｕｍ已有的研究表明，微生物参与下的碳酸盐矿物沉淀过程有可能成为固定大气ＣＯ２［１～３］，和对纪念碑等石质文物的风化表面进行修复［１］的理想途径．碳酸盐矿物形成过程中的共沉淀原理很可能在治理被重金属污染水体方面发挥重要的作用［４］．由细菌诱导形成的碳酸盐矿物有可能具有特殊的形态并因而成为寻找地外生命的重要线索［５，６］．可见，微生物诱导碳酸盐矿物形成的过程在很多方面都具有十分重要的意义．许多微生物都具有促进碳酸盐矿物形成的能力［７］．它们的种类繁多，分布广泛．它们之中既有好氧的也有厌氧的，既有自养的也有异养的，既有细菌又有真菌．从系统分类的角度来看，报道较多的细菌有芽孢杆菌［８，９］、梭菌［１０，１１］和蓝细菌［１２］等．从细菌特殊功能的角度来看，研究较多的有硫酸盐还原细菌［１，２］、嗜盐菌［３］、尿素分解菌［１３，１４］等．微生物参与下的碳酸钙系列矿物的形成过程十分复杂．它既与微生物本身的性质有关，同时还受物理化学环境（温度、ｐＨ值、碱度、盐度和Ｍｇ２＋浓度以及有机分子的种类和浓度等）的影响［２］．在Ｃａ２＋ＣＯ２－３Ｈ２Ｏ体系中，不同类型细菌诱导形成的矿物在种类上有所不同，相同类型的细菌在不同的条件下也可以形成不同种类的矿物．例如，芽孢杆菌作用下既可以形成方解石［９，１５］，也可以形成方解石＋球霰石组合［８］．蓝细菌作用下既可以形成方解石［１６］，也可以形成方解石＋文石组合［１７］．据报道，在嗜盐菌、黄色杆菌和黄色粘球菌作用下，分别形成单水碳钙石［１８］、球霰石［１９］和方解石＋球霰石的组合［２０］．大部分微生物参与的实验中形成球形和菱面体形状的碳酸盐矿物［８，９，２１］，但也经常见到杆状［１０，１７］、哑铃形［２，９，１１，１５，２０，２１］和饼状［９］等奇特的形貌．作者认为，这些结果未必能够真实地反映各种微生物诱导矿物形成的实际能力，因为研究者往往是根据微生物类型来确定实验条件（尤其是培养基成分），这导致实验结果缺乏可对比性．为此，本文利用从同一土壤样品中６６６第６期李福春，郭文文三种好氧细菌诱导碳酸钙矿物的形成分离得到的三种好氧细菌在Ｂ４培养基中、在完全相同的条件下进行了为期４０ｄ的培养实验．通过对沉淀物重量、溶液的某些理化性质及矿物种类和形态等的测定和观察，讨论了三种好氧细菌在促进碳酸盐矿物形成以及对所形成矿物种类和形态影响方面存在的差异．１实验材料和方法１．１供试菌株特征及鉴定结果利用Ｂ４培养基从采自南京植物博览园的黄棕壤（ｐＨ＝７．７４）中分离细菌．Ｂ４液体培养基的配制将２．５ｇ乙酸钙和４ｇ酵母粉溶于１Ｌ去离子水中，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ值至８．０（灭菌后ｐＨ降低至７．０５左右）．在液体培养基中加入２％的琼脂即得到Ｂ４固体培养基．固体培养基用于筛选、富集和纯化细菌，液体培养基用于碳酸盐的生物矿化实验．经多次纯化后获得编号分别为ＧＷ－１、ＧＷ－２和ＧＷ－３的三株细菌．ＧＷ－１菌株的基本特征生长迅速，在２４ｈ以内即可在平板上形成成熟的菌落．菌落呈圆形、白色，直径３～６ｍｍ．ＧＷ－１菌株具有较强的水解淀粉的能力，呈革兰氏阳性反应．菌体呈杆状，有卵形中生芽孢，常排列成对或链．菌体大小约（２．０～３．０） μｍ（１．０～１．５） μｍ，菌体周生鞭毛（图１ａ）．ＧＷ－２菌株的基本特征生长较快，大约２４ｈ就可以在平板上形成成熟的菌落．菌落透明、隆起，直径约１ｍｍ，表面光滑，边缘整齐．不具有水解淀粉的能力，革兰氏染色呈阳性．菌体呈杆状，有中生芽孢，大小约（０．７～１．１） μｍ（０．４～０．７） μｍ（图１ｂ）．ＧＷ－３菌株的基本特征生长相对较慢，大约需要７２ｈ才能在平板上形成成熟的菌落．菌落为黄色，直径１～２ｍｍ，挑起时有粘稠感，具有水解淀粉的能力，呈革兰氏阳性反应．菌体呈短杆状，大小约（０．７～１．０） μｍ（０．４～０．６） μｍ，菌体侧生鞭毛（图１ｃ）．１６ＳｒＲＮＡ测序及根据测序结果构建的系统发生树说明，ＧＷ－１菌株与Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ（登录号ＫＣ４７８３５９）的相似度为１００％，ＧＷ－２菌株与Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．（登录号ＡＢ２７１７４３）的相似度为９９．９％，ＧＷ－３菌株与Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅ－ｒｉｕｍｓｐ．（登录号ＡＪ２７７８４０）的相似度为１００％．因此，ＧＷ－１菌株可能为蜡状芽孢杆菌，ＧＷ－２和ＧＷ－３菌株可能分别为赖氨酸芽孢杆菌属和微杆菌属中的某一个种．图１ＧＷ－１、ＧＷ－２和ＧＷ－３菌株在平板上生长４８ｈ的ＴＥＭ照片ａ－ＧＷ－１菌株，菌体呈杆状，有周生鞭毛；ｂ－ＧＷ－２菌株，菌体呈杆状；ｃ－ＧＷ－３菌株，菌体呈短杆状，有侧生鞭毛Ｆｉｇ．１ＴＥＭｉｍａｇｅｓｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｓＧＷ－１，ＧＷ－２ａｎｄＧＷ－３ｇｒｏｗｉｎｇｏｎｔｈｅｐｌａｔｅｆｏｒ４８ｈｏｕｒｓａ－ｒｏｄｌｉｋｅｃｅｌｌｉｎｓｈａｐｅｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－１ｗｉｔｈｆｌａｇｅｌｌａａｒｏｕｎｄｔｈｅｃｅｌｌｓ；ｂ－ｒｏｄｌｉｋｅｃｅｌｌｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－２；ｃ－ｓｈｏｒｔｒｏｄｌｉｋｅｃｅｌｌｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－３ｗｉｔｈｌａｔｅｒａｌｆｌａｇｅｌｌａ１．２培养实验方法用接种环分别将生长于Ｂ４固体培养基上的ＧＷ－１、ＧＷ－２和ＧＷ－３菌株的成熟菌落各一环挑起并接种于盛有１００ｍＬ液体培养基的三角瓶中（初始ｐＨ值为７．００，１ｄ后细菌数量可达ｎ１０７ｃｆｕ／ｍＬ水平）．将三角瓶置于恒温培养箱中并在３０℃条件下连续培养４０ｄ．每个实验设置３个重复．在细菌实验的同时，本文还完成了一组无菌对照实验．１．３主要的观察和测定方法采用稀释平板法对细菌进行计数．用离心法将固相和液相分７６６南京大学学报（自然科学）第４９卷离．使用ｐＨＳ－３Ｃ型ｐＨ计和ＤＤＢ－３０３Ａ电导率仪分别测定液相产物的ｐＨ值和电导率．用去离子水清洗固相产物数次以去除菌体及细菌分泌的有机物，然后使用万分之一天平称量并用差减法获得沉淀物的重量．利用理学Ｄｍａｘ－Ｂ型Ｘ－射线衍射仪（ＸＲＤ）测定固相产物的矿物成分．制样方法为用滴管将沉淀物涂在载玻片上，自然风干．测定条件Ｃｕ靶，Ｋ α，管压３５ｋＶ，管流２０ｍＡ，２／ｍｉｎ，步长０．０２，测定范围１０～６０．利用配有能谱仪的ＪＳＭ－６４９０型扫描电子显微镜（ＳＥＭ）观察矿物形态并测定其化学成分．制样方法用牙签粘取少许颗粒并用无水乙醇冲洗至样品台上，自然风干后喷上约８ｎｍ厚的金膜．ＳＥＭ／ＥＤＳ测定条件为工作电压２０ｋＶ，电流６０ μＡ．利用Ｈ－７６５０型透射电子显微镜（ＴＥＭ）观察菌体形态．制样方法将平板上的单菌落悬浮于双蒸水中，将悬浮液滴于铜网上，然后加磷钨酸负染１６ｓ，待样品自然风干后上机观察［１１］．２实验结果和讨论２．１沉淀现象和反应溶液特征在三种细菌作用下均形成了一定量的碳酸盐沉淀，而对照实验中未生成沉淀．这充分说明三株细菌均有促进碳酸盐矿物形成的能力．对比可以发现，ＧＷ－２菌株作用下形成的沉淀物数量明显多于ＧＷ－１菌株和ＧＷ－３菌株（图２ａ）．三株细菌促进矿物形成能力的大小顺序是ＧＷ－２＞ＧＷ－１＞ＧＷ－３．细菌实验的培养液之电导率均低于对照实验，而且电导率降低的顺序与沉淀物质量增加的顺序一致（图２ｂ）．因此可以认为，电导率降低是游离的Ｃａ２＋与ＣＯ２－３，结合形成碳酸钙沉淀所致．图２细菌作用下４０ｄ后沉淀物重量（ａ）、培养液的电导率（ｂ）和ｐＨ值（ｃ）柱状图Ｆｉｇ．２Ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓｏｆｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｗｅｉｇｈｔ（ａ），ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ（ｂ）ａｎｄｐＨｖａｌｕｅ（ｃ）与初始ｐＨ值相比，对照实验的ｐＨ值基本上没有变化，而细菌实验均有不同程度的升高．这说明三株细菌的新陈代谢活动均可以导致溶液的ｐＨ值升高－这正是碳酸盐矿物形成的先决条件［２２］．在本文的实验体系中，下列４个过程均可能对ｐＨ值产生影响（１）细菌消耗有机碳源并分泌低分子量有机酸；（２）细菌呼吸作用产生的ＣＯ２溶于水以及后来生成ＣａＣＯ３沉淀的系列反应；（３）细菌消耗有机氮源并产生氨气，氨气溶于水生成ＮＨ＋４ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ→ＮＨ＋４（ａｑ）＋ＯＨ－；（４）死亡的细菌自溶导致ｐＨ值发生变化．细菌自溶是一种普遍现象．自溶过程中细胞内含物释放并逐渐降解，最终导致ｐＨ值发生变化［２３］．但到目前为止，未见研究报道“ 细菌自溶导致ｐＨ值升高／降低” 的问题．为此，本文跟踪测定了ＧＷ－２菌株（接种数量约为０．８３１０７ｃｆｕ／ｍＬ）和ＧＷ－３菌株（接种数量约为０．９４１０７ｃｆｕ／ｍＬ）失活（１２１ ℃，２０ｍｉｎ）后的ｐＨ值．结果表明，溶液的ｐＨ值由低到高的顺序为ＧＷ－３＞ＧＷ－２＞无菌对照（图３）．可见，细菌死亡后的自溶过程使溶液ｐＨ值升高．需要指出的是，培养基的主要成分是乙酸钙和酵母粉．乙酸钙为弱酸强碱盐，呈碱性．酵母粉是有机氮源的主要成分，水解后也可使溶液８６６第６期李福春，郭文文三种好氧细菌诱导碳酸钙矿物的形成呈碱性．因而，图３中的无菌对照实验也显示ｐＨ值有逐渐升高的趋势．可见，在上述４个过程中，前两个过程导致ｐＨ值降低，后两个过程导致ｐＨ值升高．在实验初始阶段，第一个过程可能占主导地位，使培养液的ｐＨ值略微降低．当细菌的繁殖进入对数生长期后，后３个过程为主．其中，有机氮源被降解和细菌自溶对ｐＨ的影响可能更大，因此实验结束时培养液的ｐＨ值均高于初始值．其中，ＧＷ－２升高的幅度最大，达１．６６个单位．图３ＧＷ－２和ＧＷ－３菌株失活后ｐＨ值的动态变化Ｆｉｇ．３ＴｅｍｐｏｒａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｐＨｖａｌｕｅｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｓＧＷ－２ａｎｄＧＷ－３２．２三种细菌作用下形成的矿物种类在碳酸钙系列的三种不含水同质异象变体（方解石、文石和球霰石）中，方解石是热力学上的稳定相，而球霰石为不稳定相［２４］．球霰石在水溶液中通常会在较短的时间内转变为更稳定的相，在室温下２０～２５ｈ内就转变为方解石［２５］，在６０℃条件下在１ｈ内转变为文石［２６］．从图４可以看出，ＧＷ－１菌株和ＧＷ－２菌株均诱导形成了方解石，而在ＧＷ－３菌株作用下形成的矿物却是球霰石．依我们目前所掌握的知识还无法解释这三种细菌是如何控制ＣａＣＯ３多型的尤其是ＧＷ－３菌株如何使球霰石能够稳定存在４０ｄ的通常，矿物在生长过程中可将细菌分泌的部分有机物质吸附在表面并最终包裹进入其内部．在此，很有可能的是，ＧＷ－３菌株分泌的有机物质明显不同于另外两株细菌．它们可能有利于球霰石的结晶并能够阻碍其发生相变，使其停留在Ｏｓｔｗａｌｄ－Ｌｕｓｓａｃ阶段定律的中间阶段．Ｃ－方解石（ｃａｌｃｉｔｅ）；Ｖ－球霰石（ｖａｔｅｒｉｔｅ）图４ＧＷ－１、ＧＷ－２和ＧＷ－３菌株作用下形成沉淀物的ＸＲＤ图谱Ｆｉｇ．４Ｘ－ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｏｇｒａｐｈｓｏｆｔｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅａｔｔｈｅ４０－ｔｈｄａｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎｓＧＷ－１，ＧＷ－２ａｎｄＧＷ－３２．３三种细菌作用下形成的矿物形态三种细菌作用下形成的矿物形态均比较单一．在ＧＷ－１作用下形成的矿物基本上全部为四方双锥状（图５ａ）．其中，绝大部分颗粒表现为一个锥发育较好、另一个锥发育不完全．极少数矿物颗粒的两个锥都发育完全或发育都不好．从发育不完全的锥的截面可以看出，四方双锥实际上是由显微长条状晶体构成的集合体（图５ｂ）．ＧＷ－２菌株作用下形成的矿物大部分为半球状，偶见六方柱状．半球状矿物的外表面粗糙，由棱角分明的微晶体构成．从半球的截面可以观察到，其内部为放射状排列的长条状矿物，同时还显示出同心环状构造（图５ｃ）．同心环状构造可能是矿物阶段性生长留下的印记．六方柱的横截面上可见六边形凹槽，柱面由无数三角形板片构成（图５ｄ）．从２．２的ＸＲＤ结果可以看出，ＧＷ－１菌株和ＧＷ－２菌株诱导形成的矿物具有相同的内部结构（均为方解石）．那么，从理论上来讲它们也应该具有一致的外形，因为晶体外形与其内部的微观结构具有对应关系［２７］．然而ＳＥＭ显示的实际情况是，在两种细菌作用下形成的方解石具有完全不同的外形．作者目前尚未找到合适的解释．ＧＷ－３菌株作用下形成的矿物全部为球形，球体的大小悬殊，最大者直径可达１５０μｍ，最小者不到１５μｍ（图５ｅ，ｆ）．９６６南京大学学报（自然科学）第４９卷图５ＧＷ－１、ＧＷ－２和ＧＷ－３菌株作用下形成的矿物ＳＥＭ照片ａ－ＧＷ－１，分散的四方双锥状方解石颗粒，锥的发育程度不同；ｂ－ＧＷ－１，有一个锥发育不完全的四方双锥；ｃ－ＧＷ－２，半球状方解石颗粒，外表面由棱角分明的微晶体构成，内部具有放射状和同心环状构造；ｄ－ＧＷ－２，六方柱状方解石，其横截面上可见六边形凹槽，柱面由无数三角形板片构成；ｅ－ＧＷ－３，多个大小悬殊的球形球霰石，最大者直径１５０μｍ，最小者不到１５μｍ；ｆ－ＧＷ－３，球形球霰石，表面比较光滑，直径约１１０μｍＦｉｇ．５ＳＥＭｉｍａｇｅｓｏｆｃａｒｂｏｎａｔｅｍｉｎｅｒａｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎｓＧＷ－１，ＧＷ－２ａｎｄＧＷ－３ａ，ｂ－ｉｍａｇｅｓｏｆｃａｌｃｉｔｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－１，ａ－ｓｅｖｅｒａｌｓｑｕａｒｅｄｉｐｙｒａｍｉｄ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｆｃａｌｃｉｔｅｗｉｔｈｐｙｒａｍｉｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｅｘｔｅｎｔ；ｂ－ａｓｑｕａｒｅｄｉｐｙｒａｍｉｄ－ｌｉｋｅｃｒｙｓｔａｌｏｆｃａｌｃｉｔｅｗｉｔｈａｄｅｆｅｃｔｉｖｅｐｙｒａｍｉｄ；ｃ－ａｈｅｍｉｓｐｈｅｒａｌｃａｌｃｉｔｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－２ｓｈｏｗｉｎｇｕｎｓｍｏｏｔｈｓｕｒｆａｃｅｍａｋｉｎｇｕｐｏｆｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｓａｎｄｒａｄｉａｌａｓｗｅｌｌａｓｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｉｎｎｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｄ－ａｈｅｘａｎｇｕｌａｒｐｒｉｓｍｏｆｃａｌｃｉｔｅｉｎ－ｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－２ｓｈｏｗｉｎｇａｈｅｘａｎｇｕｌａｒｆｌｕｔｅｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｓｅｃｔｉｏｎａｎｄａｌｏｔｏｆｔｒｉａｎｇｌｅｏｎｔｈｅｏｕｔｅｒｓｕｒｆａｃｅ；ｅ－ｓｅｖｅｒａｌｓｐｈｅｒｉ－ｃａｌｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｆｖａｔｅｒｉｔｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒａｉｎＧＷ－３ｗｉｔｈｍａｘｉｍａｌｄｉａｍｅｔｅｒｏｆ１５０μｍａｎｄｍｉｎｉｍｕｍｄｉａｍｅｔｅｒｌｅｓｓｔｈａｎ１５μｍ；ｆ－ａｓｍｏｏｔｈｓｐｈｅｒｉｃａｌｖａｔｅｒｉｔｅｉｎｄｕｃｅｄ

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