燃煤型砷中毒患者皮损微卫星不稳定性的检测.pdf

遵义医学院 硕士学位论文 燃煤型砷中毒患者皮损微卫星不稳定性的检测 姓名袁伟 申请学位级别硕士 专业内科学 指导教师张信江 2003.5.16 罐士精襄鲰牛盏袍史拳撼蓦E 冲审膏鹿角H 电攮■k 置J L 幂捌} 麓嚏垂精璃l 燃煤鎏肄孛毒患者受损微显星不稳定性酶硷测 攮要 目的探讨微卫星不稳定性及融和性尝失在燃煤型砷中毒患者皮肤瘸炎 发生发腻中翻干棼用。 蠢法豫攥受驳瘸瑗缀织学捡凑缝暴黠燃漾鍪l 瓣中毒惑毳逶孬分灌，这取 T P 5 3 ．P C R l 5 、D 9 S 3 1 92 个微卫璧多态热轹遮，梁惩P C Ry - 壤一变瞧聚嚣 烯酰胺凝胶电泳一银染滋检测其皮损中擞卫星不稳定性状况。采用爿7 检 验分祈徽卫星不稳定性旃皮损的临床分庾、病瓒分型的关系。 结果籍捷爨煤鍪秘串毒受擐蘩缆徽翌鬟不稳崽缝豹教生率海 3 2 4 ％ 1 1 ／3 4 ，杂秘性豢失静发囊率鸯1 4 7 ％ 5 ／3 4 ，徽墨星誉稳定毪与 1 临床分艘、瘸蠼分塑之间统计学分褫芜盥藿性豢彝黔珙幽K _ r J 绪论染色体1 7 p 1 3 ．1 ，, 9 p 2 1 上存在的p 5 3 ，静懈掷瘸藻霸粥j 钕活以及 1 擎5 3 ．P C R l 5 ．, D 9 S 主1 9 2 令镦童鼗霞熹藏黛摹麓巍辩警疲零簿发生袭纛 癌变中越燕要传粥。擞羹攫不稳定性帮杂会缝鬟受霉缝楚簿枣毒皴疫蔌癌 f 的～个堂舞机制。 关键词砷中毒；徽翌塑D N A ；徽卫基术稳定憔≯杂裔悭丢失 礤士磷冀。鱼．牛娥沧文崧埔墨} 删I 串葺L 患j } 皮授饿置熏幂冀定娩的撞镰I D e t e c t i o no fM i e r o s a t e l l i t el n s t a b i l i t yi nl e s i o n s o ft h ep a t i e n t sw i t hc o a l b u r n ta r s e n i s m A b s t r a c t o 毯e c t i v e l no r d e rt Oe l u c i d a t et h es i g n i f i c a n c eo f b o t hm i e r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y M S I a n dl o s so f h e t e r o z y g o s i t y L O H i n t h ep a t h o g e n e s i so f a r s e n i c - i n d u c e ds k i n l e s i o n s ，e s p e c i a l l ys k i nc a r c i n o m a ，t h ep r e s e n c eo f M I S a n dL O Ha tt w ol o c i 【c h r o m o s o m e1 7 p 1 3 ，t T P 5 3 ．P C F Lp 5 3 a n d 9 p 2 1 D 9 S 3 1 9 ，p 1 6 ] w a s e v a l u a t e d ． M e t h o d s U s i n gp o l y m e r a s ec h a i nr e a t i o n P C R - d e n a t u r e dp o t y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s - s i l v e rs t a i n i n g ，at o t a lo f 3 4s a m p l e s o f a r s e n i c - i n d u c e ds k i n l e s i o n sw e r ed e t e c t e df o rM 戳a n d L O H ，a n d t h er e s u l t sw 辨e 嘲p a 诧畦w i t h t h ec l i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r a m e t e r st o o ． R e s u l t sI na r s e n i c i n d u e e 症s k i nl e s i o n so f 3 4c a s e s ．t h ei n c i d e n c eo f m i e r o s a t e l l i t ei n s t a b i l i t y M S I w a s3 2 ．3 5 ％0 1 ／3 4 a n dt h e l o s so f h e t e r o z y g o s i t y L O H 1 4 ．7 0 ％ 5 ／3 句．C l i n i c a l l yp a t h o l o g i c a lg r a d e ss h o w e d n o d i f f e r e n ti ns t a t i s t i c a la n a l y s i s P O ．0 5 ， ’ C o n c l u s i o n sT h et u m o r s u p p r e s s o r ’g e n e i n a c t i v a t i o n6 n 赫t w o td i f f e r e n tL o c i T P 5 3 。P C R l 5a n dD 9 S 3 1 9o n ．c h r o m o s o m e s1 7a n d9 a n dM 辍掇 y b e i m p o r t a n t f a c t o r si nt h eg e n e s i sa n d d e v e l o p m e n t o f a r s e n i c - i n d u c e ds k i n l e s i o n s 。M S la n dL O H m a yp l a y ac e r t a i nr o l e 瀛t h ec a r c i n o g e n e s i sa n d p r o g r e s s i o no f a r s e n i c * i n d u c e d s k i nl e s i o n s ． K e y w o r d sA r s e n i cp o i s o n i n g ；M i c r o s a t e l l i t eD N A ；M i c r o s a t e l l i t ei n s t a b i l i t y ； L o s so f h e t e r o z y g o s i t y 2 礤士胃} ，摹点牛馥{ 枣眨撼味蕾￡辞争毒冀詹褒擐谳鼍J L 暴髓定性壶垂饕骥 燃煤型辩孛毒患者皮摆徽卫星不稳是镶豹检溅 前言 t 无机砷是一种致皮脓肿瘤物，可引超皮肤鳃织增生、角化过废和胂瘸 澎痰。辩是致戆皮默潦童兰要发雯予疆稳缔中毒爨蠹。燃溪受磷中毒 C o a l A r s e n i cP o i s o n i n g ，C A P 鼹特定地区居民困长期燃用高狲煤致空气、食品瀚 染覆雩；越熬馥瘦获矮枣受主憝稷靛全赛戆疾褒。爨建巍主要纛每C A P 瘸嚣， 融发现瘸人26 0 0 余人，受威胁人口近7 万1 1 1 ，痫变以皮肤损害为主，胰 攒主要鸯镶诧避液、增生健斑块蒜，并有少数笈鼹为瘦默癌，虱皮肤癌麓 妻要死因之- - 1 2 l 。皮肤癌霹为鳞状细胞瘗、基底缨胞癌及祷温瘸 B o w e n s d i s e a s e ，B D 。这些商砷煤引起的砷中毒病例太多经二巯基丙醇殿二巯撼 丁二酸镳等驱辩势耪蓬援渣疗爨，瞧、嚣张念璧簿整，金隽症状嗔屡改善， 而角化、增生性皮损却逐渐加重，宣至怼变。该现象提j j 聋无机砷可能释 羧缨魏遗簧黪囊D N A 弱攒穆，嚣缎蕤D N A 臻蘩搿戳零致D N A 复制镑诿。 躐往对砷中毒的研究表明，砷可掷} 制D N A 的损懒修复{ “ l 。D N A 镫配修 笺洳i s m a t c hr e p a i r , M M R 是天黉D N A 髂囊稷镄巾秘嚣簧稳或部分，巍消 除D N A 禽成错误，增加染色体燮制的傈冀性，臃止基因自发突变。微蔓 趱不稳定辛耋 m i c r o s a t e l l i t ei n s t a b i l i t y ，M S l 广泛存在于各种静瘤组织中，它 爱躞了黪癌D N AM M R 累绞缺黪及黪瓣缨瞧饕瓣举稳定瑷象 ，被诀必楚 继癌基因岛抑癌撩因之艏，肿瘸发病机制的分子搬物学研究的馘热点。本 研究采黉P C R - - 变毪蘩舞爝聚骏凝黢固秽婚} 毫浓一镶豢攘謇援测了2 6 铡 C A P 患者3 4 个皮损中微m 星改燮 m i c f o “I e l l i t e ，a l I e m t i 蝴龄M A s ，包括了 M S I 及杂台毪丢失 L o s so f h e t e r o z y g o s i t y , L 嵇蛩，并努辑它镪蜀褊凑及病 理特征的哭系，探讨砷中滤致皮赋瘗彀缴耀撬避。 一 ． 妻竺墨苎 兰竺蕊燕 竺竺 苎竺曼赞苎苎苎至苎苎竺竺憨竺 材料与方法 l 。材j l l i } 1 ．1 研究对象 1 ．1 ，l 惑者缀2 6 铡C A P 意者均校鬟灌桎秘巾毒渗瑟瑟准确诊，其中勇 1 2 例，女1 4 例。年龄2 8 ～6 5 岁，平均5 4 ．6 岁。病程2 ～2 6 年，平均1 7 ．6 年。按照慢性鞠巾毒I 淼床分瘦标准嘲 袭1 ，萁中I 覆8 例，I i 度{ 2 例， I I I 度6 例 图1 、2 、3 、4 、5 。 表1 懂健砷中毒旗床分瘦标准 皮肤体症 I 6 l I 。I I I 。 掌疑角纯掌强熬饕麟擦郏佼掌嚣热纯数鐾壤攀繇霸铯量斑块 散谯角化悛丘疹， 多，照米粒至绿豆状，手飓背部亦有 针尖大小大小黩疹出现 瘦获麓悉释羧、鹜散在藐氅魏色辍毽多 舒尖滔黢霸熬于麓毡斑 斑点分布，针尖大一绿赢大小 ，扩展点增大，密集分布 小 至霆艘蠖互摆融会 皮获色沉皮肤颜色耥深或浅皮获黧灰褥截或弱深褥色麓至熊色斑 褐魏细小色素沉着显鲍拇饿斑点点 { ．1 ．2 对照缀1 8 耩尖锐潼疣悫黉系我辩} j 诊簌天，掰雀癀秘瓣鞭豢尖锐 湿疣诊断标准确诊。其中男8 例，女l O 倒。举龄1 9 “ 5 8 岁，平均2 9 ．3 岁。瘸襁0 ．5 ～8 年．平均0 ．9 年。 ． 1 ．2 标本采集C A P 患者病例缀标本均强蠹娜簿兴仁豢交拳瘸区现场采 一 集，选取的皮损主要为攀跖部角化过度憔或丽稀瘗变豹皮损组织。按皮肤 痰理维织添捡法麸- 2 6 瓣C A P 崽喾‘凌取瘦摸缀织豁令，、臻取黪立霹将皮 损组织姆外观磁常皮肤缀织分开，皮掼缌织分为随份，一份用祸尔马林固 定，勇一份与穗应歪鬻瘦获缝绞绦存予滚蘸审，然螽予．8 0 “ C 低温冰籀保 存直至提取基因组D N A 。对照组；采集尖锐濑糖瘫转组织予- 8 0 ℃低温冰 箱保存，丽i } 雩抽取静赫斑2 m l E D T A 抗凝 用作徽卫凝不稳定性分析。 1 ．3 试刹所有试剂均为龄柝纯 A C SG r a d e 或超级．缝 U l t mP u r eG r a d e ，尘 吲l 士讲竞黛- 牛业性t 尊撼堪．髭叫扣毒意者度攮刊漉置年犍竞隹曲撩馕l 要试裁麴予上海生工生穆●稷公司和华受生物工程公司。 l 。3 ，l D N A 撼疆试裁T r i s A M R E S C O ，U S A E D T A A M R E S C O ，U S A S D S A M R E S C O ，U S A 饱和瀚 S m g o n 玉水乙醇 遵义赢等师专能学试 潮厂 骚自酶K M a r e k ，G e r m a n y , 胰R N A 酶 华美生物工程公司 秀戊 黪 广建晓学谈弃厂 筑傍 上海试滔赫缝纯工骞菠公司 l ，3 ．2P C R 扩增试剂即用P C R 试剂盒 上海擞工生物工程公司 1 ．3 ．3 S l2 物选取9 号染色体和1 7 号染色体上2 个D N A 微卫星 m i c r o s a t e t l i t e , M S 多态性檬涎D 9 S 3 1 9 秘T P 5 3 。P C R l 5 ，分别艇予絷热髂 9 p 21 和17 p 13 ．1 ，引物序列来自G e n o m eD a t a b a s e h t t p ／／w w w ．g a b ．o r g ， 萼l 物出上海生王生鹈z 程公锈舍残，M S 往点韵德息详觅表2 袭2 徽翟壤多态据毒教其g l 物彦襄 1 , 3 。4 璩糯赣瑰濠茨鬟蛊惑泳试糕璩瓣糖签汹 1 0 0 b pD N A l a d d e r D N A 分子量撵度标凇，华荧生物工程公司 P A G E 魄泳玻璃扳戆纯处 骥试剂 A M R E S C O ，U S A 掰稀酸胺 A M R E S C O , U S A 甲叉勰嚣稀躐胺 A M R E S C O ，U S A 藩索 A M R F 蒸C O ，u S A 去寨子肇虢] 陵 A M R E S C O ， U S A T E M E D A M R E S C O ，U S A ． 1 ．3 ．5 锻染试剂硝黢银 A M R E C O ，U S A 露水碳黢钠 A M R E S C O ， U S A 硝酸 遵义高等筛专化学试剂厂 甲醛 熏痰笼枫纯举试帮厂 苁羧 黧痰衷努试蘩厂 * 目k 粼* 中j ‘怠≈r 皮损饿m l 不穗定性的检Ⅷ 豳1 孚L 头籀妖 錾3 搏湿瘸 圈2 疣糗角琵 瓣4 基疯细藏癌 图5 蔟底细箍癌 6 堪埔．撇砷中年．患．斯皮扭散溅擞不穗城慨，的检涮 图6 巍头瘤样增生 H E 染色4 0 0 匿7 焦纯进度 H E 染色2 0 0 x 鬓8 基麋继照瘗 H E 染色∞0 蠲9 基藤缨整癌 H E 染毪4 ∞ 7 浊磷冀漓净避{ 棼丈臻嫌堑肆中弗患者寝掇饿王重幂犍瘫燕姆鞋硼 1 4 主要仪器与设镑台式高速离心撰 5 4 t 5 D ，E p p e n d o r f , G e r m a n y 多臻 能梯艨P C R 仪 E p p e n d o r f , G e r m a n y 电泳仪 B i o - R a d ，U S A M i n i - P R O T E I N3E | e c t r o p h o r e s i sS y s t e t r i B i o - R a d , U S A D Y Y - I H 3 t A 燮 电泳榭 北京六一厂 电热恒温水温箱 上海暇用恒激设备厂 电子分 褥天乎 1 ／t 0 0 0 0 ，S a r t o r i u s ，G e m l a n y 螽斌p H 仪 J e n 黼y , 冰酗台式怒声 细胞破郴仪 M S E ，U N K 全自勘数码成像及分奄唾系统 S y n G e n e , C a m b r i d g e , E n g l a n d 紫羚分毙竞度诗 7 5 0 I 蓬，上海天美科学仪器有限公弼 光学鼹 微镜 O y l m p u s ，J a p a n 2 ．实骏方法 2 ．i 实验壤蚕 2 ．1 ．1 玻璃器烈的准备赝存量燧、烧栉、容量瓶、试烈艇、移渡管均熙洗 涤帮剩浚疆，浸羧 耄锻酸镩 2 4h ，蠢来承竞矜冲挽，蓬蒸永波洗2 ～3 次，2 0 0 ℃烘烤3h 容爨魏爨 O ℃烘予 。- 2 ．1 ．2 擞料制晶的准备T i p 头、微量离心管、P C R 管均缀离燕灭蔺处理。 2 。2 试裁恕蠹裁 2 ．2 ．1D N A 抽提试勰的黼制 、 2 ．2 ．1 ；1 2 0 m g ／m l 虽塞酶K 黎取2 0 m 8 j 簧鑫黎K 。蘧魏承i 嘲鞋l 溶解， 分装备用。 2 ．2 ．1 ．2 1 0 ％S D S 称取5 9S D S ，精趣毵承溶群，定褰予5 0 m l 。。 2 ．2 ，l 。3 0 ．S m o l ／L E D T A p H 8 ．o 猕取绣添霉摘姥趣除奎} 蚤◇，嚣缝瘩7 0 m l 溶解，用1 0 MN a O H 调p H 值为8 ．0 ，越髓永定豁予1 0 0 m l 。 2 ．2 。l ，4l m o l , r LT r i s e l p r i g ．0 鼗凝1 2 。1 8 。T d s ，越魏零瓣聪港掰，露骧熊 酸调p H 值为8 ．0 ，超纯水定容予1 0 0 m I 。 2 ．2 ，l ；5 童琶缓碲滚蛰辩．妨寡 澄碾警鬣5 m ll m 0 1 ] LT r i s ．e l p H 8 ．∞，t m l 0 , S m o l ／LE D T A p H8 。o ，蜃取4 9 4 m l 超纯水。混勾。 磺尘磅究赢弗盘嚣t 蒜壤瓣肆孛毒意毒痰疆椎童l 幂羲魁犍辞樯蒋 2 ．2 毛6 D N A 按罐缓羚滚穆彀簇t L N A 酶2 m g ，藜痰壤警溪彀| m o | ／L “ I r i s e l1 m l ，O ，5 m o l ／LE D T A2 0 m l ，1 0 ％S D S5 m l ，超纯水定容予1 0 0 m l ， 1 5 “ C 蕊激毫嚣嚣存薮予滗溢。 ⋯ 2 。2 ．1 ．7 髓壤e 仿／异戊醇 2 5 2 4 1 爨戢5 0 m l 饱萋H 隧，4 8 m l 氯傍、2 m 辨 筑簿，溉岛，褚澎予棘毪试帮弑巾。 2 ．2 。l ，8 缀傍t 羚戊醇稼；莲1 爨驳9 6 m t 煞绥、4 m l 器发黪，潺匀，髅零予 棕色试剂瓶中。 2 。2 。2 逡涤试赛匏酝裁 2 , 2 ．2 ．1 1 ％琼脂糖凝腔波称取O ，3 9 琼脂糖，3 0 r a l0 , 5 T B E 缓冲波加热 港簿。 2 ．2 ．2 ．2 4 0 ％丙稀l l ；} 胺档贮液猕取3 8 9 丽稀酰胺、2 9 舣丽稀酰敝，超媳 零6 5 m t ，予3 彳| c 承浴孪* 髓其溶瓣，定容至I O O m l ，徐存予稼色试粥藏率。 2 , 2 ．2 。3 8 ％交蛙聚露烯酰胺凝艘滚称瑕勰g 掭爨，量墩t O t a l4 0 ％N 繇懿 黢存贮溅、t o m t5 T B E 缓冲液，超纯承定容蕊5 0 m l 。剧烈搅拌使其潴 蕊，撼毯试裁糕4 ℃爨秽。 ， 2 , 2 ．2 ．4 变性载样缓冲i 蠛刻度I 殁管吸取搬离子举酰胺9 ．9 m l ，群p 头吸取 2 5 驻| E D T A 0 ．5 m o l t L ，辩霉羹≥5 ％2 苯毒张1 2 ．5 pl ， 舅溪辩兰猃 S 州，澜匀。棕徼试热糕4 ℃保襻 2 ．2 ．2 ．55 X T B E 嫒耱液稼取谢s5 镌、疆教 2 7 魂，黼黼璇2 0 m i l m o l ／LT r i s e t ，纯承溶群，定容母1 0 0 0 m 1 0 璩爨壤毫遮懋瞧s 髑器缓冲 液，交髓聚器糯虢胺凝麟震宣电泳用I ⅪT B E 缓冲渡。一 2 ．2 。3 键染试蘩熬器裁 。 、 2 ．2 ．3 ．1 1 0 ％乙醇囊取滗水乙醇5 0 m l ，她水4 5 0 m l ，混匀。 Z 2 。3 2 1 ％麓羧裁囊骧整暖壤l s 醛滚磷壤辫辫瓣叁9 8 妻m l 缝承孛， 滟匀。 研士研究生牛业饨‘文蒜煤魁砷中搴患●r 皮扭做卫丑不穗定性的楂镰， 2 ．2 ．3 ．3 0 ．0 2 8 m o l ／L 硝酸银称取1 ．O l O g 硝酸银溶解于5 0 0 m l 纯水中。 2 ．2 ．3 ．4 O ．2 8 m o l ／L 碳酸钠 含O ．0 1 9 ％甲醛 称取无水碳酸钠3 0 9 ，8 0 0 m l 纯水稍加热溶解，加入甲醛 3 8 ％ 5 0 0 ul ，混匀。 2 ．2 ．3 ，5 1 0 ％乙酸量取冰乙酸1 0 0 m l 、纯水9 0 0 m l ，混匀。 2 3 实验步骤 2 ．3 ．1C A P 皮损的病理分型取福尔马林固定的病变组织石蜡包埋、切片， H E 染色，光学显微镜下观察鉴定其病理组织类型。按照慢性砷中毒皮肤 病理改变分型标准I7 1 ，将C A P 皮损组织分为三种类型，即良性型疣状 角化、乳头状瘤；中间型老年角化病样、毛囊角化病样、博温氏病样、 皮角样、角化棘皮瘤恶性型博温病、基底细胞上皮癌、鳞癌。本组中 良性型1 3 例，中间型1 6 例，恶性型5 例 图6 、7 、8 、9 。 2 ．3 ．2D N A 抽提参照分子克隆【8 J 有关章节提供的方法，分别提取C A P 皮损组织、相应正常组织，尖锐湿疣疣体组织及血液淋巴细胞的D N A 。 2 ．3 ．2 ．1 皮肤组织D N A 的提取取出冷冻组织样品，去除筋膜及结缔组织， 剔除皮下组织，分离病损处及病损旁外观正常皮肤，添加液氮于预冷 ．2 0 ℃ 研钵中，在研钵中将切碎的组织研磨成匀浆状，移入l O 倍体积抽提缓 冲液中，3 7 ℃温育lh 后加入蛋白酶配终浓度O ．1 9 ，L ，混匀后5 6 “ C 水浴 3 ．5h ，分别用等体积酚- 氯仿- 异戊酵 2 5 2 4 1 抽提2 次，氯仿．异鹰醇 2 4 1 抽提1 次，将上相液体用2 ～2 ．5 倍体积冷冤水乙蓐沉淀，1 2 0 0r p r n 离心 5 m i n ，沉淀用体积分数7 0 * ／, 乙醇漂洗2 次，室沮干燥，加5 0 耻l T E 溶解 沉淀。经紫外分光光度计定量后，．2 0 “ 2 保存备甩。 2 ．3 ．2 ．2 外周血淋巴细胞D N A 韵提取采用攀觌低渗溶赢法提取基因组 D N A 。取5 0 0 I ．tl 血液，加入l m l 无蕾双蒸水，5 0 0 0r p m 离心5m i n ，去 上清后将分离得到淋巴细胞核溶予抽提缓冲液巾，以下步骤同发肤组织标 本提取。 啊士研兜生牛业匏’文基爆型砷中毒患者皮撮徽z 置不嗣L 定性．的楂铡 2 3 3P C R 扩增5 0 p1 反应体系含1 0 0 n g 模板基因组D N A ，5 0 m 0 1 ，L 的 日1 物各lu 1 ，2 X P C R M a s t e r 含3 m m o l ／L M g C l 2 、0 ．2 m m o l ／L d N T P 、0 ．1U ／ uIT a qD N A 聚合酶、2 X P C R 反应缓冲液 2 5ul ，d d H 2 0 补至终体积5 0 u1 。混匀后，瞬问离心，置于多功能梯度P C R 仪内扩增。扩增条件为 9 5 ℃2m i n 后，经9 4 ℃4 5s 一5 5 ℃4 5s 一7 2 ℃1r a i n4 0 个循环，7 2 ℃延 伸5m i n 。每组P C R 扩增设置无模板对照 空白对照 ，以超纯水代替模 板基因组D N A ，引物、2 P C R M a s t e r 及扩增条件均与研究组相同，以排 除基因组D N A 的污染。 2 ．3 ．4 琼脂糖凝胶电泳检测P C R 扩增产物用l ％的琼脂糖倒胶 含溴化 乙锭终浓度为O ．5 l ；I ∥u I ，凝胶凝固后，加入0 ．5 T B E 电泳缓冲液，将 1 0 ulP C R 扩增产物与lul 上样缓冲液 O ．2 5 ％溴酚蓝一4 0 ％蔗糖水溶液 混匀依次加样，8 0 V 恒电压电泳5 0m i n ，在透射紫外灯下观察结果，确定 有P C R 阳性产物的标本用于微卫星不稳定性分析。 2 ．3 ．5 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳取l O 以8 ％变性聚丙烯酰胺凝胶溶 液 含7 m o l ／I 尿素 ，加入1 0 u l T E M E D 和5 0 I l l1 0 ％过硫羧胺，混匀后， 以“H 灌胶法”制胶，室温下待胶聚合后，拔出梳齿，冲洗加样孔，安装 于电泳模块中，加足电泳缓冲液l T B E 。1 5 0 V 辔压预电泳3 0m i n 。取 P C R 扩增产物l oul ，与等体积∞变性簸样缓冲液褪念后| l { 9 5 ℃变性5 m i n ，冰水浴中骤冷，逐一上样，憾电压1 5 0 v ，屯泳2h 。 2 ．3 ．6 银染电泳结柬后，小心撬开2 块玻璃扳，戢离凝胶．参照文献M o I - 依以下步骤染色①1 0 ％L 醇固定5m i n ，双蒸水漂洗I 血n ；②1 ％硝酸浸 泡5r a i n ，双蒸水漂洗I m i n ； 萤0 ．0 1 2 m o F L 硝酸银染色2 0r a i n ，双蒸水漂 洗2 0 ～3 0s ④o ．2 8 m o l ／L 碳酸钠和0 ．0 1 9 ％甲醛溶液显色5 ～1 0r a i n ，轻 轻摇晃，至出现清晰条带⑤加l ∞‘冰己魏终止反应3r a i n 双蒸水漂 洗干净。 磺士磷鬻袅牛盘静文藕臻型肆串毒盘毒寰撩懒置置幂碱震缝鸯擘籀粥 2 ．3 ．7 爨像分褥采臻金魏蘑凝黢努撰攀绫，嚣蘧袋棼e 辩警赣箨获彀簧爨， G e n e t o o l s 软件 版本3 ，o o ．1 3 分析擞胶图像。 3 。续鬃粼蘩最染螽戆瞧瀑象露添藩，黧稼爨惫；可嚣扩躜戆M S t 褒纛鬣 不连续的条带。将皮损缀纵譬熊相应难常组织P C R 缩聚比较，麓皮擐缀 织夔菜一条等德蕊蠢条鬻港失袋糖蔻密壤减少5 0 ％磷j 二，焚嚣最为L O t t ； 黪皮损缀织的祭港与藏嫩相比，擞现等能基爨撩糖的燃察，或爨现条带撩 移率辩敬变，释定为M S l 。 4 。绞诗努据采怒x 2 检验势掇M S I 帮L O H 在苓圆l 逡臻势蹙、滤壤分篓之 润表达的差异饿。 结慕 ’ D 9 S 3 1 9 冀T P 5 3 ．P C R l 5 砖个M S 键点经P C R 扩墩瓣，产物与l o o b p D N A 分子蠢耨；礁豹M 稍泔及元横板对照管衡袋艘物同时上样襻琼脂糖电 淑，经G e n e t o o l s 救转努麟，D 9 S 3 1 9 戆终麟长凌熬1 9 3 ～2 2 ．0 b p , T P 5 3 P C R l 5 的片断长度为1 { 。7 1 3 2 b p ，证獬为P C R 静_ 增酌蒜标产物酒1 0 、l1 。 C A P 受臻辩S 旁爨臻P C R 扩灌毒爨2 穆豢豢} 一爨热露l ；二楚至黪鞋。 2 6 例C A P 患者3 4 个皮搦组织中肖l l 份标本表骥M S I ，5 份标本装现L O “。 缘会M S I 器L O H ，共骞l 鑫铪C A P , , 嶷簧酥簿辫瓣M R s 。E O s 3 t 9 、 T P 5 3 ．P C R l 5 微擞屋位意的M S I 、L O H 妖裳爨肄及蕊n e t o o l s 坎盼给檄缱 。“ 。j ’ 榘冤霭1 2 、1 3 、t 4 ．1 5 、1 6 、1 7 。 l 。不翻挺点懿磁辩黪L O H 颗攀露囊数， ’、 表牿2 两个黟态位点L 0 1 1 、醛l 嫡聚 多态寝点 NL O HM S IM A s D 9 s 3 1 9 3 44 、‘ 3 、‘ 萱P S 3 ．} C 袋1 5 3 4I89 食计 3 4 5 l l 1 6 硪咖耕究生毕北论文糟．珀L 烈捌* 中膏．患栩P 皮损微黑巍不稳定能的检测 3 4 例C A P 披损中M S 檀点M S I 梭出率为D 9 S 3 1 9 8 、8 2 ％， T P 5 3 ．P C R l 52 3 ．5 3 ％，憨麓蛙率为3 2 ，3 5 ％；L O H 裣窭搴为D 9 S 3 t 9 1 1 。7 6 ％，T P 5 3 ．P C R l 529 4 ％，总阳性率为1 47 0 ％。联合分析M S I 、L O H ， M A s 辍洼率迭4 7 ，爵5 ％ 1 6 穆蓬 ，强链点醚A s 梭毫率之藏差癸无显蔫链 x 2 2 ．0 4 ，P _ 0 ．0 5 。 国1 0D 9 s 3 1 9 微卫星桡点P c R 扩增质琼脂辅电泳结暴 I O O b p 蹦A 分子羹拣准； T r a c k l 1 0 栋本扩增样鼎 C 焉横扳对照 空白对髓 蓬1 lT P 5 3 ．趟R i 5 徽里麓挺点 P C R 扩增石琼脂糖屯泳结果 M l O O b pD N A 分子量标准； T r a c k I ．s 标率扩增棒蠡 T r a c k 9 。1 0 ；未上样 C 舞摸板对照 空白对鼎 1 3 ∞蛾∞L * 中毒怠蒲 攫饿* 鼻L { 穗愈性的检测 图1 3c a s e 7 电泳条带G - c n a o o l s 软件分 辑缝采翦头示皮损缎织扩增象带强度减 弱 红线；皮损缀织D N A 扩增条带 蓝线正常缀织D N A 扩增条带 图1 2 T P 5 3P C R l 5 位点M S I 、 L G 睡重图铡 c a s e 7 皮损组织出现扩增条带强度 减弱，定为L O H ，如箭头所示； c a ∞8 瘦蓣绥缓出现条带迁移率改 变，定为M S I ，如箭头所示。 L 皮摆维织N 正嚣维织 c 无模板对照 空白对照 M 桉酸分子蠼标准 图1 4c a s e 8 漱泳条带C r e n c t o o l s 软件分 析结暴箭头示皮损组织扩增条带迁移率 改变 红线皮损组织D N A 扩蠼条带 绿线正常组织D N A 扩增条带 1 4 ∞- * 粼砷中葺‘患斯皮授m * l 不植怠性的检测 图1 6e a s e l 3 电泳条带G e n e t o o l s 软件分 辑缩采箭头示皮撰缀织扩增条带迁移率 改变。 红线；皮损缀织D N A 扩增条整 绿线正常组织D N A 扩增条带 圈1 5 D 9 S 3 1 9 位点M S I 、L O H 图例 e a s e l 3 皮捅组织出现扩增条带迁移率改 变，定为M S I ，辩箭头所示； c a s e l 5 皮攒组织出现扩增条带强度减弱， 定淹L O H ，如箭头联示。 L 皮损纽织；N 正常组织 圈】7e a s e l 5 电泳条带＆n e t o o l s 软件分 析结采箭头示皮攒组织扩增条带强度 减弱。 红线皮损组织D N A 扩增条繁 绿线威常组织D N A 扩增条带 2 ．临床分度与M S I 和L O l l 的关系 表3 从表3 中可以器出，在检测欧8 倒l 度、1 2 铡I I 度葶鞋6 铡I I I 瘦C A P 硪士研究生平业论文 燃埔．参￡砷中●} 患者皮扭做卫J L ．不穗定性的检洲 临床分度总数 M S I I 度 I I 度 I I I 度 8 1 2 6 0 2 3 8 1 0 3 2 6 3 6 6 3 合计 2 65 2 11 I2 6 3 ．病理分型与M S I 和L O H 的关系 表4 表格4 不同病理分型L O I { 、M S I 结果 病耋分例数_ F 土垡L _ j _ 鱼堕I _ _ 良性型 1 30 1 331 0 中间型。1 621 461 0 恶性型 5 3223 合计3 452 9l l2 3 x 。 1 0 ．4 7P 0 ．0 5 从表4 中可以看出，L O H 的阳性率与瘸理分裂关系显著 z 2 1 0 ．4 7 P 如．0 1 ，M S I 的阳性率在各病理分型之间财嚣显著差异 X 2 0 ．8 5 ，P 0 ．0 5 4 ．研究组与对照组微卫星改变 M A s 对照分析 表‘5 袭格5 研究组与对照缱徽温羞改变 组别 n 上素手坠] i 陌二 研究组3 41 61 8 对照组1 821 6 合计5 2i 83 4 6 司E 士崭朔；生牛域悖史蜒埔．型砷中毒- 意毒糠鲴E 饿卫L 幂羽L 定性捌”瞻翻 3 4 镄燃煤鍪秭中毒渡搂发生M A s1 6 翻，1 8 铡尖锐渝筑发生M A s2 例，研究组与对照组之问M A s 发生率有显著性差异 Ⅳ。 5 ．2 2 ，, o - 0 ．0 5 。 ’ 讨像 秘终为环壤毒携侵人类羧癌 皮获癌、g 毒癃积黪靛癌等 已免大爨嚣 流行瘸学所证实，但j c 寸其致艨作用机理一直没有使人信服的说法。到目前 麦壹，港未复麓蠢瑾怒熬秘致癌豹动物模墅。麓着分予生物学羧零静发展， 人类对砷的致癌机理进行了有益的探索。目前认为砷具有促裂变原样作 焉，胃诱导入炎淋巴细胞染色体分裂，两干扰D N A 损伤的修复{ 3 1 。R o s s m a n 等将其毒不同修复功能的大肠抒菌进行u v 照射，秀惩亚弛黢镳处理，指 出砷对大肠秆菌依赖R e c A 的D N A 复制后修复有抑制作用{ 4 1 。另有撤道 砷对人体表皮缀织缨熬受u v 照懿弓| 起抟D N A 援痿的修复溪链骞按露l 终 ， 用。O k u i 等对三价砷 A s 2 0 3 和五价砷在正常人纤维细胞经u V 照射以 嚣D N A 掺笺孛豹效纛遴行7 辑究，绥莱衰赘捧霹致E 暇矗骖复箨臻麓撺 制【5 J 。目前多数研究者认为，砷通过抑制与D N A 修复稍荚的D N A 连接酶 或与D N A 蘩篪酶静巯萋结合，经该辩酶疆毪繇祗，觚蔗捧制镅旎D N A 损伤的修复。 ● 入类基因缀中禽肖太薰串联重复拨替藏序掰，囊鬟痔捌中震复单彼相 同，其重复单缎为I - - 6 b p ，璧袈次数1 0 - - 6 0 次，嚣兔徽漤星 m i r e o s a t e l l i t e , M S 或短串联煎复 s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，S W g s 。M S l 黪墩鼍笺涮错误弓I 起 戆D N A 楚荤鬟复彦列耱扩增辘丢失，褒嚣必瓣癣缝筑鸯冀稳瓣疲豹j ≥耱 瘤组织D N A 结构性等位基因的大小发生改变．微卫题D N A 的稳定性可 作为衡羹纲稳藻霞缀整棒稳寇往热蠹好标记，萋霭内缓萋西辩证徽滋星 D N A 的不稳定，能童接诱发这些基殿的表达耱麴缝舱菠变，从藤引发疾 病。L O H 是指肿瘤基因组中特定染色体- f 某种D N A 多森标记的等位慕因 冀叛，} 彝弱一患者轰霉缀织基阑缀救爨耪变成一耱，秘囊杂窝状态交为拳 破士研冀燕．毕韭{ 争冀．赫- 柏t 蚕￡坤巾毒患者皮攥赣卫L 幂羲定谴自缸赣辅I 合性 h e m i z y g o s i t y 、纯墼生 h o m o z y g o s i t y 或零会性 n u l l i z y g o s i t y 。L O H 是肿瘤细胞中染色体缺失的表现。有学者‘“】认为如果某一肿瘤在某条染色 体上弱一位点经露笈q - L O H ，那么丢失懿部绽多为瓣癃害牵秘蒺霞 t u m o r s u p p r e s s o rg e n e ，T S G 所在。通过L O