高效石油降解菌的筛选及其生长特性研究.pdf

高效石油降解菌的筛选及其生长特性研究 * 卜云洁1王鑫1王学江1刘免2颜湘波1赵建夫1 1． 同济大学环境科学与工程学院 污染控制与资源化研究国家重点实验室， 上海 200092; 2． 浙江伟明环保股份有限公司， 上海 200120 摘要 从上海、 大连和天津的附近海域海水中分离出的 15 种石油降解菌中筛选出 6 种柴油降解率在 75 以上的高效 石油降解菌 D3、 T4、 Ｒ4、 T1、 D4 和 Ｒ3。经 16S rDNA 测序鉴定， D4 和 T4 属假单胞菌属， D3 和 Ｒ4 属短波单胞菌属;Ｒ3 属迪茨菌属， T1 属盐单胞菌属。分析 6 种菌株在 3 种培养基中的生长特性发现， 在 LB 培养基中， D4 的适应期较长， 需要 25 h， 而稳定期较短; 在葡萄糖培养基中， Ｒ4 在 3 d 后进入稳定期， 适应期较长， 其他 5 种菌株在 2 d 后就进入稳 定期; 在柴油海盐培养基中 6 种菌株在 3 d 后生物量出现明显增长， 其中 Ｒ3、 Ｒ4 和 D3 的生物量高于 T1、 D4 和 T4 的 生物量。对比 6 种高效石油降解菌株在 3 种培养基中的生长状况得出其生长的难易顺序是柴油海盐培养基 ＞ 葡萄糖 培养基 ＞ LB 培养基。 关键词 柴油; 石油菌; 培养基; 生长特性 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201405038 STUDY ON SCＲEENING AND GＲOWTH CHAＲACTEＲISTICS OF SOME OIL DEGＲADING STＲAINS Bu Yunjie1Wang Xin1Wang Xuejiang1Liu Mian2Yan Xiangbo1Zhao Jianfu1 1． State Key Laboratory of Pollution Control and Ｒesource Ｒeuse，School of Engineering，Tongji University，Shanghai 200092，China; 2． Zhejiang Weiming Environmental Protection Company，Shanghai 200120，China AbstractThere were fifteen oil strains isolated from the seawater samples in Shanghai， Dalian and Tianjin respectively． Six strains named D3、 T4、 Ｒ4、 T1、 D4 and Ｒ3 were picked out for their oil degradation rates were over 75． 16S rＲNA sequencing were conducted to identify the six strains，the results showed that D4 and T4 were Pseudomonas sp． ， D3 and Ｒ4 were Brevundimonas sp． ， Ｒ3 was Dietzia sp． ， T1 was Halomonas sp． Growth characteristics of the six strains in three different culture medium were analysed， the results showed that D4 had a longer adaptation period of 25h， but a shorter period of stabilization in LB culture medium． In glucose culture medium，Ｒ4 came into stabilization stage after three days’culture and had a longer adaptation period， while the other five strains came into stabilization after two days’culture． In diesel- sea salt culture medium， the six strains had an obvious increase in biomass and the biomass of Ｒ3、 Ｒ4 and D3 were more than that of T1、 D4 and T4． Compared with growth characteristics of the six strains in three different culture medium， it is concluded that the growth difficulty consequency is as follows diesel- sea salt culture medium ＞ glucose culture medium ＞ LB culture medium． Keywordsdiesel;oil degrading strain;culture medium;growth characteristic * 国家自然科学基金面上项目 51179127， 21277097 。 收稿日期 2013 －07 －02 0引言 随着全球工业进入快速发展的时代， 其对石油及 其产品的需求量日益增大。由于石油的大量开采和 使用以及一些漏油事故的发生， 使得石油污染成为当 今环境问题的热点［1- 2 ］。石油进入土壤会影响土壤通 透性， 减少土壤肥力， 阻碍植物生长; 进入水体会影响 水气交换， 对水生生物产生毒害作用， 并可通过食物 链富集; 同时石油当中的一些挥发组分能引起人体麻 痹、 窒息和化学性肺炎等疾病［3- 5 ］。 目前， 对于石油污染的修复方法包括物理方法、 化 学方法和生物方法。物理方法采用吸附的方式， 对于 低浓度石油污染收效甚微; 化学方法通过喷洒化学消 油剂， 其二次污染问题一直颇受争议; 生物修复方法通 过微生物的生长代谢达到对污染物彻底矿化的效果， 561 土 壤 修 复 Soil Ｒemediation 无二次污染产生， 在近年来的一些溢油事故中取得良 好的应用效果， 受到外界的普遍关注 ［ 6- 7 ］。生物修复法 的核心是微生物的选择 ［ 8- 15 ］， 筛选能够高效降解石油 烃、 环境适应性强的微生物对于提高最终修复效果至 关重要。本文选取受石油污染的海水， 对其中的微生 物进行进一步的驯化、 分离、 筛选以及鉴定， 并对其降 解能力以及生长特性进行了初步考察， 以期能够找到 高效石油降解菌， 为我国石油污染治理工作提供支持。 1试验部分 1. 1试验水样及培养基 本试验用于分离、 筛选的水样取自上海市淞沪码 头和天津滨海新区受原油污染的船舶港口和大连近 海域的表层海水。试验采用的培养基包括 人工海水培养基 MMC NaCl 24 g， MgSO4 7H2O 7. 0 g，NH4NO31. 0 g，KCl 0. 7 g，KH2PO42. 0 g， Na2HPO43. 0 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 为7. 2 ～ 7. 4; 121℃灭菌 20 min 后补加适量经 0. 22 μm 滤膜过滤 除菌微量元素液， 并补以柴油作为唯一碳源。 LB 培养基 NaCl 5 g， 蛋白胨 10 g， 酵母提取物 5 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 为 7. 0 ～7. 2。 葡萄糖培养基 葡萄糖3 g; NaCl 5 g， 酵母提取物 3 g， 蛋 白 胨 3 g， K2HPO43H2O 2. 7 g， 蒸 馏 水 1 000 mL， pH 为 7. 2， 115 ℃下灭菌 15 min。 柴油海盐培养基 海盐 35 g， 柴油质量浓度为 0. 2， 蒸馏水 1 000 mL， pH 为 7. 0 ～7. 2。 油培养基 人工海水培养基灭菌后加入含一定量 经单独灭菌的柴油。 油平板 人工海水培养基中加入 1. 5 ～ 2. 0 的琼脂制成平板后， 再涂覆 200 μL 已灭菌的柴油。 牛肉膏蛋白胨斜面 牛肉膏 3 g， 蛋白胨 10 g， NaCl 5 g， 琼脂 15 ～ 20 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 为 7. 0 ～7. 2; 121 ℃灭菌 20 min 后制成斜面。 试验过程中用到的溶液包括 微量元素混合液 CaCl22 mg/L， FeCl36H2O 50 mg/L， CuSO40. 5 mg/L， MnSO4H2O 0. 5 mg/L， ZnSO4 7H2O 10 mg/L。 磷酸盐缓冲液 K2HPO421. 75g， Na2HPO433. 4 g， KH2PO48. 7 g， NH4Cl 5. 0 g， 蒸馏水 1 000 mL。磷酸 缓冲液用于洗涤、 制备菌悬液。 1. 2试验测试项目及方法 微生物生物量采用光电比浊法， 用 UV- 4802 双 光束紫外可见分光光度计以 600 nm 波长处培养液的 OD 值表示。 柴油浓度的测定基于 ET1200 水中油分浓度分 析仪， 水样首先经四氯化碳 环保级 萃取水中油分 萃取采用 ET3200B 自动萃取仪， 萃取 2 min ， 通过 测定 2930 cm －1 CH2基团 CH 键的伸缩振动 、 2 960 cm －1 CH3基 团 CH 键 的 伸 缩 振 动 、 3 030 cm －1 芳香基环中 CH 键的伸缩振动 谱带 处的吸光度 A2930、 A2960、 A3030计算而得。降解率 1 － 残余柴油浓度/空白柴油浓度100 1. 3石油降解菌的驯化、 分离纯化、 筛选及鉴定 分别移取 10 mL 水样置于盛有 20 mL 生理盐水 的三角瓶中震荡摇匀， 用移液枪吸取 5 mL 水样加入 装有 100 mL 有培养基的三角瓶中， 置于摇床 25℃， 180 r/min 培养 7 d， 再取 5 mL 富集液接入相同的新 鲜培养基， 如此富集 3 次， 逐渐提高柴油浓度驯化， 再 用油平板进行反复分离、 纯化得到单一菌株。 从平板上挑选适量菌体于 50mL 的 LB 培养基 中， 在 25 ℃、 180 r/min 条件下富集培养 3 d， 对培养 液进行离心后去除上部培养液， 用磷酸缓冲液反复清 洗 3 次， 并制成 OD600值相同的菌悬液。 取1 mL 菌悬液加入50 mL 柴油浓度1 600 mg/L 的人工海水培养基中， 在 25 ℃、 150 r/min 的恒温振 荡培养箱中培养 7 d 后测定柴油浓度， 计算降解率。 选取高效石油降解菌采用 16 s rDNA 测序分析 鉴定菌种。 1. 4高效石油降解菌在不同培养基上的生长特性 取 1 mL 菌液分别加入 50 mL 的 LB 培养基、 葡 萄糖培养基和柴油海盐培养基中， 在 25 ℃、 150 r/ min 的恒温振荡培养箱中培养， 通过测定 OD600反应 培养基中微生物的生长状况， 每次测定做三组平行， 取平均值绘制高效石油降解菌的生长曲线。 2结果与讨论 2. 1高效石油降解菌的筛选与鉴定 将上海、 天津、 大连附近海域的水样经过驯化、 分 离后得到 15 株石油降解菌， 将其加入柴油浓度 1 600 mg/L的人工海水培养基中得到的 7 d 降解率 如图 1 所示。 从图 1 可看出 分离出的 15 种石油降解菌其对 柴油的7 d 降解率均在40以上， 其中以 D3、 T4、 Ｒ4、 T1、 D4 和 Ｒ3 的降解能力更为突出， 降解率均在 75 以上。武金装等 ［16 ］从油污土壤中分离出石油降解菌 对 1 000 mg/L 柴油的最大降解率为 80; 王世杰 661 环境工程 Environmental Engineering 图 1分离出的 15 种石油烃降解菌对柴油的 7d 降解率 Fig． 17- day’ s diesel oil biodegradation rates of fifteen oil degrading isolates 等 ［17 ］研究表明高浓度柴油能够抑制菌株生长， 降低 降解率， 其分离出的石油降解菌对浓度为 1 的柴油 降解率为 58. 6， 对浓度为 10 的柴油降解率仅为 18. 2。本试验中 D3、 T4、 Ｒ4、 T1、 D4 和 Ｒ3 菌株与 以往研究结果相比具有良好的降解潜力， 选为高效石 油降解菌株。这 6 种高效石油降解菌的菌落特征见 图 2。 图 2 6 种高效石油降解菌的菌落特征 Fig．2Colony characteristics of six kinds of efficient oil degrading strains 从图 2 可以看出 6 种石油烃降解菌的菌落均为 圆形， 表面湿润。其中 D3 在油平板上菌落为桔黄色， 液体培养时， 分泌较多丝状生物表面活性剂 Ｒ4 的菌落 为淡黄色， 菌落比 D3 要大， 液体培养时生物表面活性 剂较少; D4 菌落为较大， 乳白色而 T4 菌落很小， 透明， 且分泌较多表面活性物质， 以至于菌落不明显; Ｒ3 菌 落米黄色， 菌落较小， T1 则只生长在油滴汇集的边缘， 菌落黄色， 液体培养时， 无明显生物表面活性剂， 菌液 均匀。通过16S rＲNA 测序分析结果见表1。 表 1 6 种高效石油烃降解菌鉴定比对结果 Table 1Identifying and contrast of six kinds of efficient oil degrading strains 菌编号菌属种名相关度 D3短波单胞菌属Brevundimonas diminuta99 D4假单胞菌属Pseudomonas sp． OK1_1_1b3_S597 Ｒ3迪茨菌属Dietzia sp． BBDP4995 Ｒ4短波单胞菌属Brevundimonas sp． S- SL- 194 T1盐单胞菌属Halomonas venusta99 T4假单胞菌属Pseudomonas aeruginosa94 从对比结果可以看出 D4 和 T4 均属于假单胞菌 属， D3 和 Ｒ4 属于短波单胞菌属; 而 Ｒ3 属于迪茨菌 属， T1 属于盐单胞菌属。 2. 2高效石油降解菌在 LB 培养基中的生长特性 分别将 1 mL 6 种高效石油降解菌的菌悬液接种 至 LB 培养基中得到的生长特性曲线如图 3 所示。 图 3 6 种高效石油降解菌的生长特性曲线 Fig．3Growth curve of six kinds of efficient oil degrading strains 从图 3 可以看出 接种至培养基的初期， 微生物 处于调整期， 开始适应新的环境， 菌体数目基本不增 761 土 壤 修 复 Soil Ｒemediation 加。T4、 Ｒ3 和 Ｒ4 的适应期较短， 只需要 10h 就进入 对数增长期， 而 D4 的适应期较长， 需要 25 h， 但 D4 的对数期较短， 只需要 15h， 其他菌株则需要 20 ～ 25 h; T4 和 D4 的稳定期较长持续了 20 h， 而 D3、 Ｒ3 和 Ｒ4 的稳定期较短只持续了 10 h。 2. 3高效石油降解菌在葡萄糖培养基中的生长特性 分别将 1 mL 6 种高效石油降解菌的菌悬液接种 至葡萄糖培养基中得到的生长特性曲线如图 4 所示。 图 46 种高效石油降解菌在葡萄糖培养基中的生长曲线 Fig． 4Growth curve of six kinds of efficient oil degrading strains in dextrose culture- medium 从图4 可以看出 除 Ｒ4 以外， 其他5 种菌株均在 第 1 天之后生物量迅速增长并达到最大， 从第 2 天以 后逐渐趋于平稳。Ｒ4 在前 3 d 生物量均处于逐渐增 长的状态， 第 3 天以后生物量趋于平稳。对比 6 种菌 株在稳定状态下的 OD600值可知， T1 在葡萄糖培养基 中生长而得到的生物量要大于其他 5 种菌株， 这可能 是由于 T1 更善于利用葡萄糖作为碳源进行微生物的 生长。但高效石油降解菌在葡萄糖培养基中的生长 状况明显比 LB 培养基中的生长状况差。 2. 4高效石油降解菌在柴油海盐培养基中的生长 特性 分别将 1 mL 6 种高效石油降解菌的菌悬液接种 至柴油海盐培养基中得到的生长特性曲线见图 5。 图 56 种高效石油降解菌在柴油海盐培养基中的生长曲线 Fig．5Growth curve of six kinds of efficient oil degrading stains in diesel sea salt culture medium 从图 5 可以看出 在 7 d 的培养时间内， 石油菌 的生物量随培养时间的增加而增加， 从第 3 天之后生 物量出现明显的增长， 这是由于柴油与葡萄糖等常规 碳源相比更难于被生物利用， 因此微生物需要更长的 时间去适应环境， 同时产生相应的酶以及有助于油类 物质吸收的表面活性物质。6 种高效石油降解菌在 柴油海盐培养基中生物量不同， 其中 Ｒ3、 Ｒ4 和 D3 的 生物量要明显高于 T1、 D4 和 T4， 这可能是由于 Ｒ3、 Ｒ4 和 D3 能够更好的利用柴油作为生长所需的碳源 而 T1、 D4 和 T4 只是将柴油进行代谢降解， 而不参与 自身物质合成。对比 6 种石油菌在 3 种培养基中的 生长特性， 得出其生长的难易顺序是 柴油海盐培养 基 ＞ 葡萄糖培养基 ＞ LB 培养基。 3结论 1从分离出的 15 株石油菌中筛选出 6 株高效 石油降解菌 D3、 T4、 Ｒ4、 T1、 D4 和 Ｒ3， 其对柴油的降 解率均在 75 以上。经 16S rＲNA 测序鉴定 D4 和 T4 属假单胞菌属， D3 和 Ｒ4 属短波单胞菌属;Ｒ3 属 迪茨菌属， T1 属盐单胞菌属。 2在 LB 培养基中， T4、 Ｒ3 和 Ｒ4 的适应期较 短， 只需要 10 h， D4 的适应期较长， 需要25 h; 在葡萄 糖培养基中， Ｒ4 在 3 d 之后进入稳定期， 而其他 5 种 菌株在 2 d 之后就进入稳定期; 在柴油海盐培养基中 6 种菌株在 3 d 之后生物量出现明显增长， 其中 Ｒ3、 Ｒ4 和 D3 的生物量高于 T1、 D4 和 T4 的生物量。 3比较 6 种高效石油降解菌株在 3 种培养基中 的生长状况得出其生长的难易顺序是 海盐培养基 ＞ 葡萄糖培养基 ＞ LB 培养基。 861 环境工程 Environmental Engineering 参考文献 ［1］曲维政， 邓声贵． 灾难性的海洋石油污染［J］． 自然灾害学报， 2001， 10 1 69- 74． ［2］苏斌， 冯连勇， 王思聪， 等． 世界海洋石油工业现状和发展趋势 ［ J］． 中国石油企业， 2006 S1 138- 141． ［3］范晓宁． 烃降解菌的选育及其对海洋溢油生态修复室内模拟研 究［D］． 青岛 中国海洋大学， 2008． ［4］汪杰， 郑维爽， 礼晓， 等． 高效石油降解菌的筛选鉴定及修复能 力研究［ J］． 环境科学学报， 2010， 30 6 1228- 1234． ［5］杨雪莲， 李凤梅， 刘婉婷， 等． 高效石油降解菌的筛选及其降解 特性［ J］ ． 农业环境科学学报， 2008， 27 1 230- 233． ［6］张丽萍， 王辉． 不同海面状况海洋石油污染处理方法优化配置 ［ J］． 海洋技术， 2006 3 1- 6. ［7］EsmaeilAL- Saleh， HanaDrobiova， ChristianObuekwe． Predominant culturable crude oil- degrading bacteria in the coast of Kuwait［J］ ．International Biodeterioration ＆ Biodegradation， 2009， 63 400- 406. ［8］宋志文，夏文香， 曹军． 海洋石油污染物的微生物降解与生物 修复［ J］ ． 生态学杂志， 2004 3 99- 102． ［9］Whyte L G，Hawari J，Zhou E，et al． Biodegradation of variable- chain- length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Ｒhodococcussp［J］ ．Applied and Environmental Microbiology， 1998， 64 7 2578- 2584． ［ 10］Baptist J N，Gholson Ｒ K，Coon M J． Hydrocarbon oxidation by a bacterial enzyme systemI．Products of octane oxidation［J］ ． Biochimica Biophysica Acta， 1963， 69 40- 47． ［ 11］Beilen J B，Wubbolts M G， Witholt B． Genetics of alkane oxidationby Pseudomonas oleovorans［J］ ． Biodegradation，1994， 5 3 161- 174． ［ 12］Ijah U J J． Studies on relative capabilities of bacterial and yeast isolates from tropical soil in degrading crude oil［J］． Waste Management， 1998， 18 5 293- 299． ［ 13］Throne- Holst M，Markussen S，Winnberg A，et al． Utilization of n- alkanes by a newly isolated strain of acinetobacter venetianus The role of two AlkB- type alkane hydroxylases［J］． Applied Microbiology and Biotechnology， 2006， 72 2 353- 360． ［ 14］Delorenzo V，Timmis K N． Analysis and construction of stable phenotypes in gram- negative bacteria with Tn5- derived and Tn10- derived minitransposons［J］ ． Bacterial Pathogenesis，1994， 235 386- 405． ［ 15］Whyte L G，Bourbonniere L， Greer C W． Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane alkand naphthalene nahcatabolic pathways［J］ ． Applied and Environmental Microbiology，1997， 63 9 3719- 3723． ［ 16］武金装， 刘红玉， 曾光明， 等． 柴油降解菌的筛选及其降解特性 研究［ J］． 农业环境科学学报， 2008， 27 5 1742- 1746． ［ 17］王世杰， 王翔， 卢桂兰， 等． 柴油降解菌的筛选鉴定及其降解特 性研究［ J］ ． 农业环境科学学报， 2011， 30 1 49- 54. 第一作者 卜云洁 1989 － ， 女， 硕士， 主要研究方向水体污染防治技术。 buyunjie08163． com 通讯作者 王学江 1974 － ， 男， 教授， 工学博士， 主要研究方向水体污 染防治技术。 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 wangxj tongji． edu． cn 上接第 114 页 ［8］Kocher B，Wessolek G，Stoffregen H．Water and heavy metal transport in roadside soil［ J］ ． Pedosphere， 2005， 15 6 746- 753. ［9］Wang X S，Qin Y，Chen Y K． Heavy metals in urban roadside soils，Part 1Effect of particle size fractions on heavy metals partitioning［ J］ ． Environmental Geology， 2006， 50 7 1061- 1066. ［ 10］Ozaki H，Watanabe I，Kuno K． As，Sb，and Hg distribution and pollution sources in the roadside soil and dust around Kamikochi， Chubu Sangaku National Park，Japan ［J］ ． Geochemical Journal， 2004， 38 5 473- 484. ［ 11］马建华， 谷蕾， 李文． 连霍高速郑商段路旁土壤重金属积累及 潜在风险［ J］ ． 环境科学， 2009， 30 3 894- 899. ［ 12］Guang D S，Peart M Ｒ． Heavymetal concentrations in plants and soils at roadside locations and parks of urban Guangzhou ［J］ ． Journal of Environmental Science， 2006， 18 3 495- 502. ［ 13］Nabulo G，Oryemoriga H，Diamond M．Assessment of lead， cadmium，and zinc contamination of roadside soils，surface films， and vegetables in Kampala City，Uganda［J］．Environmental Ｒesearch， 2006， 101 1 42- 52. ［ 14］Li F Ｒ，Kang L F，Gao X Q，et al． Traffic- related heavy metal accumulation in soils and plants in northwest China［J］ ． Soil and Sediment Contamination， 2007， 16 5 473- 484. ［ 15］李波， 林玉锁， 张孝飞， 等． 沪宁高速公路两侧土壤和小麦重金 属污染状况［ J］ ． 农村生态环境， 2005， 21 3 50- 53. ［ 16］Jones K C，Stratford J A，Waterhouse K S，et al． In crease of polynuclear aromatichy drocarbon content of anagricultura soil over the last century［ J］ ． Environmental Science ＆ Technology，1989， 23 1 95- 101. ［ 17］Gorlach U，Candelone J P，Boutron C． Changes in heavy metal concentration in Greenland snow during the past twenty- three years ［J］． Heavy Metals in the Environment， 1991 1 74- 77. ［ 18］李恋卿， 潘跟兴， 张平究， 等． 太湖地区水稻土表层土壤 10 年 尺度重金属元素积累速率的估计［J］ ． 环境科学， 2002， 23 3 119- 123. ［ 19］孙艳丽， 马建华， 李剑． 郑汴路路旁土壤重金属积累及其潜在 风险评估［J］ ． 土壤通报， 2010， 41 5 1184- 1190. ［ 20］国家环境保护局， 中国环境监测总站． 中国土壤元素背景值 ［M］ ． 北京 中国环境科学出版社， 1990 87- 90， 330- 496. ［ 21］GB 156181995 土壤环境质量标准［ S］． 第一作者 范拴喜 1981 － ， 男， 讲师， 硕士， 主要从事环境分析与评价 研究。fanshuanxi123 sina． com 961 土 壤 修 复 Soil Ｒemediation