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石油污染土壤微生物修复技术研究进展 王悦明王继富李鑫陈丹宁周禹莹 哈尔滨师范大学 湿地过程与环境效应实验室， 哈尔滨 150025 摘要 石油类物质进入到土壤中不仅破坏原有生态系统， 而且严重损害人类身体健康。目前， 针对石油污染土壤的微 生物修复是一种新兴实用的污染物治理技术， 主要包括生物刺激、 生物强化、 固定化微生物技术和植物微生物联用 技术， 其具有成本低、 效率高、 消耗少、 对环境影响小和无二次污染的优点， 正逐步成为石油污染土壤治理的热点领域， 然而微生物修复技术在环境中的应用也同时具有不确定性和潜在的风险。着重介绍了目前国内外主要微生物修复手 段的研究成果及进展情况， 并对微生物修复技术的发展进行了合理展望。 关键词 石油污染; 土壤; 微生物修复 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201408037 ＲESEAＲCH PＲOGＲESS ON MICＲOBIAL ＲEMEDIATION OF PETＲOLEUM CONTAMINATED SOIL Wang YuemingWang JifuLi XinChen DanningZhou Yuying Laboratory of Wetland Processes and Ecological Effects，Harbin Normal University，Harbin 150025，China AbstractThe petroleum substances which put into the soil not only destroy the original ecosystem，but also seriouly damage to human health． Currently，the remedial measure of petroleum- contaminated soil is a new and practical means，including bio- stimulation，biological enhancement technologies，immobilized microorganism and plant- microbial detection．Microbial remediation of petroleum contaminated soil technology is one of remediation technologies in domestic and abroad，which features low cost，high efficiency，low consumption，low environmental impact and no secondary pollution． However，the bioremediation technologies，which have been applied in the environment，have uncertainty and potential risks． It was mainly introduced the scientific achievements and progress in the main means of microbial remediation at home and abroad，and a report of reasonable prospect for the development of this microbial technology was provided． Keywordsoil pollution;soils;microbial remediation 收稿日期 2013 －11 －07 0引言 目前认为石油污染土壤的形成途径有三种 落地 油污染、 污水排放和灌溉、 空气污染。石油一旦污染 土壤， 自然修复过程十分缓慢， 其理化性质以及土壤 机械组成等会发生改变 ［1 ］， 进而直接或间接地影响 农作物生理过程 ［2 ］。20 世纪 80 年代以前， 处理石油 污染土壤的主要方法是物理或化学方法， 这些方法不 仅成本高， 且后续处理比较困难。80 年代以来， 人们 将注意力转向生物法治理石油污染土壤， 通过改变生 物外部生活环境和依照生物自身的遗传变异规律提 高石油降解速度和程度［4 ］， 具有手段多样化、 降解程 度高、 代谢旺盛且代谢物无毒害［3 ］的特点， 被认为是 生态环境保护领域最有价值、 最有前途的和对土壤修 复较为彻底的污染修复技术。 1环境中降解石油的微生物 自然界中能降解石油烃的微生物广泛存在于土 壤圈、 水圈等圈层中。许多微生物具有以石油烃为唯 一碳源和能源而生长的能力。目前已发现 100 多个 属、 200 多种微生物能够氧化降解一种或多种石油烃 类。目前研究表明， 能够降解石油烃的微生物主要是 细菌和真菌。在海洋生态系统中的石油烃类降解主 要依靠细菌， 而在淡水和陆地生态系统中的石油烃类 降解中占主导地位的则为真菌［4 ］。运用微生物治理 石油污染是因其具有种类多、 分布广、 个体小、 繁殖 快、 比表面积大、 容易变异等特点。 微生物降解石油时， 其内部发生一系列酶促反 751 土 壤 修 复 Soil Ｒemediation 应， 会产生氧化还原、 脱羧、 脱氨、 脱水等作用， 因此对 于石油降解、 物质能量利用会更加高效。微生物高繁 殖率以及遗传变异性大使它的酶体系能够以最快的 速度适应外界环境的变化， 从而使微生物在环境治理 上显示出高效性和多样性， 又避免了二次污染 ［5 ］。 土壤中常见的石油降解细菌属名见表 1。 表 1降解石油化合物的微生物属名 Table 1The generic name of the microbe degrading petroleum compounds 细菌真菌 无色杆菌属 Achromobacter 分支杆菌属 Mycobacterium 枝顶孢属 Acremonium 拟青霉属 Paecilomyces 不动杆菌属 Acinetobacter 细杆菌属 Microbacterium 曲霉菌属 Aspergillus 青霉菌属 Penicillium 产碱杆菌属 Alcaligenes 诺卡氏菌属 Nocardia 白僵菌属 Beauveria 茎点霉属 Phoma 节细菌属 Arthrobacter 变形杆菌属 Proteus 葡萄孢属 Botrytis 红酵母属 Ｒhodotorula 放线菌属 Actinomycetes 假单胞菌属 Pseudomonas 假丝酵母属 Candida 酵母属 Saccharomyces 芽孢杆菌属 Bacillus 沙雷氏菌属 Serratia 金孢子菌属 Chrysosporium 齿梗孢属 Scolecobasidium 短杆菌属 Brevibacterium 螺菌属 Spirillum 枝孢属 Cladosporium 穗霉属 Spicaria 色杆菌属 Chromobacterium 链霉菌书 Streptomyces 旋孢腔菌属 Cochliobolus 弯颈霉属 Tolypocladium 棒状杆菌属 Corynebacterium 弧菌属 Vibrio 柱孢属 Cylindrocarpon 粘囊孢属 Graphium 纤维菌属 Cytophage 欧文氏菌属 Erwinia 得巴利氏酵母属 Debaryomyces 腐质霉属 Humicola 棒状杆菌属 Corynes 黄杆菌属 Flavobacterium 镰刀菌属 Fusarium 被孢霉属 Mortierella 微球菌属 Micrococcus 地丝菌属 Geotrichum 木霉属 richoderm 胶枝霉属 Gliocladium 念珠菌属 Monilia 其中假单孢菌属 Pseudomonas 、 节核细菌属 Arthrobacter 、 产碱杆菌属 Alcaligenes 、 无色杆菌属 Achromobacter 、 黄杆菌属 Flavobacterium 、 棒状杆 菌属 Corynebacterium 、 微球菌属 Micrococcus 、 诺 卡氏菌属 Nocardia 、 分支杆菌属 Mycobacterium 、 气单胞菌属 Aeromonas 、 芽胞杆菌属 Bacillus 、 拜 叶 林 克 氏 菌 属 Beijerinckia 、 蓝 细 菌 属 Cyanobacteria 、 红 球 菌 Ｒhodococcus和 弧 菌 属 Vibrio 等细菌能够很好地降解石油烃。而常见的石 油降解真菌包括为木霉属 richoderma 、 青霉属 Penicillium 、曲 霉 属 Aspergillus 、被 孢 霉 属 Mortierella 等 ［6- 8 ］。 2石油污染土壤的几种主要微生物修复技术 自 20 世纪 70 年代以来， 石油年产量逐年增加， 在 2008 年达到石油生产顶峰。石油污染土壤的微生 物修复技术逐渐成为治理石油污染的核心技术。利 用石油污染土壤环境中的土著菌种或者向受污染的 土地中施加经过驯化的微生物， 在 C/N 适当的情况 下， 其内部能将石油类物质中的烃类代谢为不饱和脂 肪酸同时产生某些双键的位移或产生甲基化， 形成脂 肪酸， 加速新陈代谢， 在氧气充足的作用下， 发生氧化 作用， 脱氢生成水和 CO2， 营养元素供微生物自身生 长并释放能量， 达到降解土壤中的石油烃的目的［9 ］。 简单来说， 这一过程可用下式表示 石油类物质 生物 O2 N 源→CO2 H2O 副 产物 细胞体。 目前， 国内外对于石油污染土壤微生物修复技术 主要包括 生物刺激、 生物强化、 固定化微生物、 微生 物植物联用等方法。 2. 1生物刺激 生物刺激法是人为地利用某些手段对石油污染 土壤中的土著菌进行刺激， 促进其繁殖与生长， 如向 土壤中通气、 添加肥料或者投入其他添加剂， 来加速 微生物生理活动， 以便达到对石油污染土壤进行降解 的一种手段 ［10 ］。其主体是土著菌， 途径是改变微生 物外界生长环境。由于自然环境中微生物种类繁多， 因此各种微生物对于石油污染土壤的降解方法、 理化 反应也不尽相同。但基本途径却大体相同 1 石油 类物质被微生物细胞膜吸附; 2 石油类物质进入微 生物内部; 3 石油类物质参与微生物生理反应， 微生 物进行酶促反应将石油类物质分解成为 CO2、 H2O 及 无污染无毒物质。目前， 国内外对生物刺激法进行了 许多研究。实验表明， 不同的生物刺激手段， 例如通 气、 添加营养物质、 电子受体、 表面活性剂等， 能够不 同程度地提高微生物对污染土壤中石油类物质的降 解程度， 具体见表 2。这种方法优点是 操作简便、 修 复后无二次污染， 应用前景具有很大潜力。不足之处 是 不同环境土壤构成、 质地等不同， 其土著菌种所需 营养物质等外部条件不同， 操作时应选择与当地土壤 环境相适应的刺激手段， 以便达到更好效果; 另外， 土 著菌种由于生长速度较慢， 代谢活性不高， 直接影响 石油降解效果。 2. 2生物强化 目前， 生物强化与生物刺激均属于目前国内外比 851 环境工程 Environmental Engineering 表 2不同生物刺激方法的石油去除率 Table 2Oil removal rate by different biostimulation s 修复途径石油去除率 电子受体提高60.8［ 11 ］ 通气提高47.2［ 11 ］; 提高20 蛭石 ［ 12 ］ 表面活性剂 提高8.8 去除高凝油 ; 提高13.2 去除稀油 ［ 13 ］ 营养物质提高28 ～39.7［ 14 ］; 提高 2 ～3［ 15 ］; 提高50 ～95［ 16 ］ 多因素改善 去除95 ～97 半透膜肥料 N/P/K ［ 17 ］; 提高约13［ 18 ］ 激活剂去除约 56. 4 氮源、 H2O2、 木屑 ［19 ］ 较有发展潜力的修复技术。生物强化修复技术主要 包括外源微生物的生物强化和本土微生物的生物强 化。外源微生物通常被认为是由于生物刺激法具有 一定的环境因素局限性， 因此在石油降解过程中， 为 了提高石油物质去除率引入的其他高效降解菌种。 这些菌种基本不属于自然环境下的土著菌种， 而属于 外来菌种。因此在接种初期， 势必会受到接种环境中 土著菌种的竞争， 修复过程中需要大量的接种微生物 形成优势种。投菌时应注意氮和磷是土壤微生物治 理系统中最主要的营养元素， 微生物生长所需的 C、 N、 P 的质量比大约为 100∶ 10∶ 1。本土生物强化技术 是由日本科学家 Ueno 等 ［20 ］在 2007 年首次提出的， 主要指从石油污染的土壤中分离出具有石油降解能 力的本土微生物， 将其培养富集后重新投入到石油污 染土壤中进行生物强化试验， 以降解石油类物质的 技术。 近年来， 人们逐渐重视和采用生物遗传工程手段 研究和构建高效的基因工程菌。具体采用的手段有 构建多个质粒的菌种、 降解性质粒 DNA 的体外重组 和原生质体融合技术等。利用生物强化修复手段， 可 以修复一些极端的， 不利于大多数微生物存在和生长 的环境。研究表明， 生物强化技术的优点是可以非常 显著地提高石油类物质的降解效率， 具体见表 3。表 3 显示， 经过生物强化技术修复后的土壤， 石油类物 质去除率明显增加。不足之处在于投入的微生物易 受土壤环境的理化性质和生物学特性影响， 在很多情 况下限制了生物强化技术的应用。因此， 如何优化生 物强化修复体系和研究出更适合的生物强化修复方 法， 使得微生物更容易适应不同的自然环境， 成为近 年来研究的热点。 2. 3固定化微生物技术 微生物固定化技术 immobilized microorganism， IM 是指利用化学或物理方法， 将游离的微生物或酶 固定在适当的载体中［26- 27 ］， 主要优点是 对进行石油 表 3不同生物强化方法的石油去除率 Table 3Oil removal rate by different bioenhancement s 修复途径石油去除率 投菌37 ～39; 对照为 不投菌 2［21 ］ 投菌 营养物质68 ～69. 4; 对照为 营养物质 30. 6［22 ］ 投菌 翻土 40 ℃ 68. 82; 对照为 不翻土 63. 91［23 ］ 投菌 调理剂51 ～62; 对照为投菌 无调理剂 36 ～ 43; 空白对照组 几乎无变化［24 ］ 投菌 土壤激活剂63. 1; 对照为投菌 无土壤激活剂 49. 4［25 ］ 降解的微生物进行固定， 可以避免人为地破坏生物体 细胞和生物酶活性以及进行生化反应的稳定性， 解决 了微生物在污染环境中容易受到外部环境条件波动 的影响 ［28 ］， 提高了单位介质中的微生物数量; 固定化 后的微生物能长期保持活性， 其生长繁殖的微环境有 利于屏蔽土著菌、 噬菌体和毒性物质对外源菌种的恶 性竞争、 吞噬和毒害， 提高固定化微生物的生存能力， 使其在复杂、 极端环境中仍可以稳定地降解石油类 物质。 近年来， 研究者们通过实验筛选出很多不会对土 壤造成二次污染、 对环境友好且可以自然降解或不可 降解的载体， 如花生壳粉末、 活性炭、 天然有机材料等 来固定微生物菌体， 解决了载体在土壤环境中不易回 收的问题， 同时也提高了石油类物质的去除率， 见 表 4。 表 4不同固定化微生物方法的石油去除率 Table 4Oil removal rate by different immobilized microorganism s 修复载体石油去除率 纳米多孔 SiO2 96. 2 /85. 4 两种菌 ; 对照为 游离态 生物 刺激 66. 2 /60. 4［30 ］ 草炭土 28. 4; 对照 空白组约12. 3， 游离态 生物刺 激24. 3［31 ］ 天然有机材料 27. 1; 对照 游离态 生物刺激约 24［32 ］ 22. 7; 对照 游离态 生物刺激约 20［33 ］ 活性炭 49; 对照 空白组13， 生物刺激26， 游离 态 37［34 ］ 聚乙烯醇 － 海藻 酸钠 78.16; 对照 空白组3.68， 游离态59.25［ 35 ］ 选择载体时， 应注意以下几个原则［29 ］ 1 具有很 强的机械和理化性质; 2 具有较强惰性， 不干扰微生 物功能; 3 具有一定容量; 4 物美价廉。 从表 4 可知 利用固定化微生物修复技术修复土 壤中的石油污染， 其石油去除率明显高于同等条件下 利用生物强化与生物刺激的方法。目前 IM 技术主 要用于流体介质 如废水 和半流体介质 如污泥 中， 在非流动介质 如污染土壤 的运用则刚刚兴起， 951 土 壤 修 复 Soil Ｒemediation 具有很好的发展前景。IM 技术的主要优点是去除效 率较高， 充分利用微生物的生物活性。缺点是固定化 微生物修复载体在土壤中的不可回收给自然环境带 来了一定的风险， 另外复杂成分的载体材料、 微生物 以及石油类物质之间的相互作用对分析降解有机污 染物的机理带来困难。因此， 在今后的研究方向主要 集中于 1 继续寻找合适的、 对环境有好的载体材 料， 载体应有足够好的强度、 惰性 ［36 ］; 2 研究载体材 料、 微生物、 石油类物质之间相互作用; 3 研究载体 材料应降低成本， 简化载体制作流程， 向利于技术的 传播与应用方向发展; 4 研究应向混合微生物固定 化、 基因工程菌种固定方向发展， 提高石油降解率; 5 研究和评估固定化载体的环境风险等。 2. 4植物微生物联用技术 在自然条件下生物刺激、 生物强化以及固定化微 生物修复技术受环境条件制约程较大， 或者有些只能 在实验室中进行， 因此污染土壤微生物修复技术效果 的关键是选择最佳生态环境条件［37 ］。相对于单纯地 利用微生物进行土壤污染修复， 植物微生物联用技 术是指植物与微生物互利作用来强化根际， 实现提高 有机物降解效率。其机理为植物根际为微生物提供 生长场所， 输送氧气， 使微生物氧化作用可以正常进 行， 同时根际分泌物质某种程度上可以刺激或加速微 生物的降解功能; 反过来微生物可以将污染物质转换 成植物可以利用的简单化合物， 降低污染物质毒性， 通过植物根的吸收作用同样达到了降解石油的目 的 ［38 ］。在植物微生物联合修复体系中， 理想的植 物应具备 1具有旺盛的须根系， 并最大可能地提 供微生物活动的根表面面积; 2生长旺盛， 对多种有 机污染物表现一定抗性; 3 根系可以伸展到较深土 层中 ［39 ］。近年来， 研究者做了大量工作， 筛选出多种 对石油有降解能力的植物和微生物组合来修复石油 污染土壤。中国科学院南京土壤研究所选用紫花苜 蓿作为宿主植物， 对长期持久性有机污染物 POPs 复合污染土壤同时接种根瘤菌剂和菌根菌剂， 改善植 物根区微生态环境， 增强污染土壤中持久性有机物的 转化能力， 明显提高了土壤中污染物质的降解或消减 效果 ［40 ］; 徐莉［41 ］等选择紫花苜蓿 Medicago sativa L． ， 同时接种苜蓿根瘤菌 Ｒhizobium meliloti 或/和 地表球囊霉 Glomus versie ， 在田间试验其对多 氯联苯 PCBs 污染土壤的修复效果， 结果表明 所有 种植植物的处理， 根际土壤 PCBs 的去除率均高于对 照， 其中紫花苜蓿并接种根瘤菌处理的土壤， PCBs 去 除率高达 42. 6; 马强 ［42 ］等发现水稻微生物联合 处理下土壤中石油烃的降解速率最快， 培养期的降解 效率达到 53. 13; 马溪平 ［43 ］等选择的芥菜、 玉米和 蓖麻皆能减少土壤总烃类含量， 降解率都在 60 以 上。 微生物与植物之间存在诸多联系， 两者有机结合 才能使石油类物质降解达到最大化， 了解二者之间共 同作用机理， 可以完善二者的联合程度， 提高石油降 解效率。目前， 植物 － 微生物联合作用机理研究主要 集中在 ［44， 45 ］ 1 根际改善微生物生长的微生态环境， 改善土壤理化性质; 2 植物根际分泌物质刺激、 强化 微生物降解作用， 或分泌酶直接参与对污染物质进行 降解的过程中， 起到对污染物质的活化作用; 3 微生 物强化植物根际的矿化作用。由于植物微生物修 复技术成本相对较高， 技术含量高， 影响植物、 微生物 的因素均能影响修复效果。在今后的实验中， 可能更 加深入的研究方向有 1 植物与微生物菌种的合理 搭配， 改进工艺， 降低成本; 2 污染土壤中植物与微 生物协同修复原理， 特别是联合修复机制、 控制因素 的研究; 3 外源微生物与土著微生物稳定共生条件 及环境响应因子的研究; 4 菌根根际微生物生理特 征及生活习性， 污染物种类和浓度对菌根根际物质和 能量流动的影响研究。 3展望 随着我国经济的发展， 依托石油化工产业的带 动， 石油需求量逐年上升。因此应用微生物修复、 处 理石油污染土壤技术是保护环境修复污染介质、 维持 生态平衡的有力保障。处理高浓度石油污染需要运 用物理法和化学法联合， 但处理后续工作较为困难， 因此有必要发展低成本、 对环境无二次污染的新型修 复技术。目前， 我国对生物修复技术主要集中在微生 物修复领域， 而植物修复、 植物 － 微生物联合修复运 用较少， 特别是对植物 － 微生物联合修复机理及环境 调控因子等还需进一步研究。因此， 要使微生物修复 技术广泛运用， 今后的研究在以下几个方面还有待加 强 1 完善技术， 优化工艺流程， 降低成本; 2 深入研 究环境影响因素的调控， 植物、 微生物与环境之间相 互作用， 这是提高石油降解率的客观保证; 3 筛选、 选育、 驯化具有高降解能力的菌种; 4 构建对于微生 物修复技术统一评价标准， 评估微生物修复技术修复 污染土壤风险; 5 提高外源菌种与土著菌种、 植物联 061 环境工程 Environmental Engineering 合共生的优化程度; 6 根据土壤特性、 区域污染程度 制定合理的针对策略， 将物理、 化学与生物修复技术 有机结合、 综合运用， 构建高效修复体系， 达到科学 性、 合理性及可行性的有机统一。 参考文献 ［1］刘其友，赵东风，张云波． 石油污染土壤生物修复技术的研究 进展［J］． 油气田环境保护， 2005， 15 4 14- 16. ［2］吴凡，刘训理． 石油污染土壤的生物修复研究进展［ J］． 土壤， 2007， 39 5 701- 707. ［3］张闻，陈贯虹，高永超， 等． 石油和重金属污染土壤的微生物 修复研究进展［J］ ． 环境科学与技术，2012，35 12 174- 181. ［4］祝威． 石油污染土壤和油泥生物处理技术［M］ ． 北京 中国石 化出版社， 2010， 33- 34. ［5］张珍明，林昌虎，何腾兵， 等． 浅析石油污染土壤的微生物修 复研究现状［J］． 贵州科学， 2010， 28 3 76- 81. ［6］唐金花，于春光，张寒冰， 等． 石油污染土壤微生物修复的研 究进展［J］． 湖北农业科学， 2011， 50 20 4125- 4128. ［7］Jensen V． Bacterial flora of soil after application of oilywaster［J］． Oikos， 1975， 26 152- 158. ［8］Bull A T，Goodfellow M，Slater J H． Biodiversity as a source of innovation in biotechnology［ J］ ． Annual Ｒev Microbiol， 1992， 40 219- 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如修复方案采用稳定 － 固定化技术， 则建议采用基于 浸出毒性的标准限值作为修复目标值。 参考文献 ［1］孙俊，陈晓东， 常文越，等． 搬迁企业环境遗留问题分析及修 复对策研究［J］． 环境保护科学， 2003， 29 11 40- 42. ［2］叶舒帆，朱彬，王强强，等． 一处电镀基地搬迁后的人体健康 风险评估研究［J］． 环境科学与技术， 2013， 36 6 451- 454. ［3］骆永明，中国污染场地修复的研究进展、 问题与展望［J］． 环 境监测管理与技术， 2011， 23 3 1- 6. ［4］De Kimple C Ｒ，Jear L M． Urban soil managementA growing concern［J］． Soil Science， 2000， 165 1 31- 40. ［5］魏复盛，陈静生，吴燕玉，等． 中国土壤环境背景值研究［J］． 环境科学， 1991， 12 4 12- 19. ［6］张长波． 污染土壤的固化 － 稳定化处理技术研究进展［J］． 土 壤， 2009， 41 1 8- 15. ［7］Kumpiene J，Lagerkvist A，Maurice C． Stabilization of As，Cr， Cu，Pb and Zn in soil using amendments- a review ［J］． Waste Management， 2008， 28 1