燃煤污染型砷中毒人群MGMT基因甲基化、转录及表达的研究.pdf

环境与健康杂志 2010 年 4 月第 27 卷第 4 期J Environ Health, April 2010, Vol．27, No．4 【论著】 文章编号 1001-5914（2010）04-0283-05 燃煤污染型砷中毒人群 MGMT 基因甲基化、 转录及表达的研究 潘雪莉 1，张爱华1 ，黄晓欣 2 摘要 目的了解 O6-甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶基因 （MGMT 基因 ） 启动子区甲基化、 转录及表达以及 DNA 甲基转 移酶 1 （DNMT1 ） 的转录及表达与砷中毒的关系。 方法采集 68 例燃煤污染型砷中毒 （以下简称砷中毒 ） 患者 （轻度 24 例、 中度 28 例、 重度 16 例 ） 及 23 例非病区居民外周血。用甲基化特异性 PCR 法 （MSP ） 检测 MGMT 基因启动子区甲基化， 实 时荧光定量 PCR （FQ-PCR ） 法检测 MGMT 及 DNMT1 mRNA 的水平。利用自愿手术治疗的砷中毒患者皮肤组织标本 61例， 其中 34 例为一般病变， 21 例为癌前病变， 6 例为癌变和对照皮肤组织标本 （15 例 ） ， 以免疫组织化学（IHC ） 法检测砷中毒 患者及对照皮肤组织中 MGMT 及 DNMT1 蛋白的表达。 结果MGMT 基因启动子区甲基化阳性率与砷中毒程度有关（χ2 13.739， P0.01 ） 。 砷中毒组 MGMT mRNA 表达水平与对照组比较， 差异无统计学意义（P＞0.05 ） ； MGMT 基因启动子区甲基 化患者和非甲基化患者之间 MGMT mRNA 和 DNMT1 mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05 ） 。但轻、 中度患者 DNMT1 mRNA 表达明显低于对照组 （P＜0.01 ） ； 癌前病变组和癌变组皮肤组织中 MGMT蛋白表达明显低于对照组（P0.01 ） ， 与皮 肤损害程度有关rs-0.446,P0.01 ） ； MGMT 基因启动子区甲基化患者 MGMT 蛋白表达明显低于非甲基化组（P0.05 ） 。砷 中毒组皮肤组织中 DNMT1 蛋白表达强于对照组（P0.01 ） ， 并与皮肤损害程度有关 （rs0.740， P0.01 ） ； 且 MGMT 基因启 动子区甲基化患者组织中 DNMT1 蛋白表达明显高于非甲基化组（P0.05 ） 。 结论MGMT 基因启动子区高甲基化抑制 了燃煤污染型砷中毒患者皮肤组织中 MGMT 蛋白的表达， 且 DNMT1 蛋白的高表达参与了此抑制过程。 关键词 砷中毒； 基因； 煤； O6-甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶基因； DNA 甲基转移酶 1； DNA 甲基化 中图分类号 R181.3； R994.6文献标识码 A Hypermethylation and Transcription and Expression of O6-methylguanine-DNA Methyltransferase Gene in Patients of Endemic Arsenism PAN Xue-li , ZHANG Ai-hua, HUANG Xiao-xin. Department of Toxicology, Guiyang Medical University， Guiyang， Guizhou 550004， China Corresponding author ZHANG Ai-hua,E-mail aihuagy AbstractObjectiveTo investigate the promoter hypermethylation, transcription and expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase geneMGMT , the transcription and expression of DNA methyltransferase 1DNMT1, and the relationship between these changes and the arsenism. sThe blood samples were collected from 68 arsenism patients （including 24 mild cases , 28 moderate cases and 16 severe cases ） and 23 controls non-arsenic exposure. The mRNA expression of MGMT and DNMT1 was detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, at the same time, the tissue samples of skin were collected from the patients with endemic arsenism total 61 cases, including 34 general pathological changes cases, 21 precancerous cases and 6 cancerous cases and from 15 controls. MGMTand DNMT 1 proteins were detected by immunohistochemical . ResultsThe positive rates of the promoter hypermethylation of MGMT were associated with the degree of arsenic poisoning （χ213.739， P0.01 ） . The average level of MGMT mRNA showed no significant difference between arsenism patients and controls（P＞0.05 ） , and no significant difference of the average level of MGMT and DNMT1 mRNA was seen between methylation group and non-methylation group of the promoter of MGMT （P＞0.05 ） ,but the average levels of DNMT1 mRNA of mild and moderate groups were significantly lower than that of the control group （P＜0.01 ） . Compared with the control group, the MGMT protein expression was lower in precancerous and cancerous groups （P0.01 ） ， which was associated with the degree of skin damagers-0.446, P0.01 ） ; the MGMT protein expression in promoter methylation group of MGMT was lower than that in non-methylation group（P0.05 ） .Compared with the control group, the DNMT1 protein expression was higher in arsenism group （P0.01 ） , which was associated with the degree of skin damag rs0.740, P0.01 ） ; the DNMT1 protein expression in promoter methylation group of MGMT was higher than that in non-methylation group （P0.05 ） . ConclusionThe promoter hypermethylation of MGMT inhibits the protein expression of MGMT, and the high expression of DNMT1 protein participates in the inhibition process. Key words Arsenic poisoning; Gene; Coal; O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene; DNA methyltransferase 1; DNA methylation 基金项目 国家自然科学基金资助项目 （30760225； 30960337 ） ； 贵州省重 大专项基金资助项目 （黔科合重大专项字 ［2006］ 6016 号） ； 省长基金 资助项目 （黔科教办 ［2004］ 07 号 ） ； 贵州省科学技术基金资助项目 （黔 科合 J 字 ［2009］ 2188 号 ） 作者单位1.贵阳医学院卫生毒理学教研室贵州 贵阳 550004； 2.中国人 民解放军第 44 医院贵州 贵阳 550009 作者简介 潘雪莉 （1973- ） ， 女， 博士研究生， 副教授， 从事地方性砷中毒 发病机制研究。 通讯作者 张爱华, E-mail aihuagy 砷及其化合物是国际癌症机构 （IARC ） 确认的人类致癌物， 也是至今在动物身上未能获得成功致癌模型的极少数致癌物之 一[1]。 砷中毒是一种可引起以皮肤色素沉着、 脱失、 掌跖角化及癌 变为主要特征的全身多器官、 系统损害的疾病。 贵州省是燃煤污 染型地方性砷中毒重病区。 阐明砷致病或致癌的分子机制， 寻找 有效的治疗药物， 是预防和控制砷中毒的关键 [2、 3]。砷在环境和 生物体内均有甲基化代谢的转换过程，砷在机体内的甲基化过 283 环境与健康杂志 2010 年 4 月第 27 卷第 4 期J Environ Health, April 2010, Vol．27, No．4 程可能会导致 DNA 甲基化模式的改变[4-7]。在体外和人群研究 中有报道， 砷可引起基因组 DNA 的低甲基化和肿瘤相关基因启 动子区的高甲基化[8-10]， 本课题组前期研究发现燃煤污染型砷中 毒患者中抑癌基因 p53、 p16 以及 DNA 修复基因 MGMT 启动子 区发生高甲基化[11,12]， DNA 修复基因 MGMT 在肿瘤的发生、 发展 和治疗中均起着重要作用。为此笔者在既往基础上， 进一步研究 砷中毒人群 MGMT 基因启动子区甲基化、转录及表达以及 DNA 甲基转移酶 1 （DNMT1 ） 的转录和表达与砷中毒发生发展的关系， 探讨 DNA 甲基化在砷中毒发生发展中的作用，为砷中毒预防和 治疗策略改进提供依据。 1材料与方法 1.1观察对象 以贵州省兴仁县交乐乡燃煤污染型地方性砷中毒病区为调 查点， 选本课题组既往观察对象 68 例， 按 WS/T2112001 地方 性砷中毒诊断标准 将其分为轻度 （24 例） 、 中度 （28 例） 和重度 中毒组 （16 例） ， 选距病区约 12 km 的非砷暴露村， 有相似生活 习惯、 无燃用高砷煤史、 无遗传及肿瘤等家族史、 体检合格并排 除肿瘤相关因素的 23 例居民作为对照组， 病例组与对照组之间 年龄、 性别无统计学差别。 知情同意原则下采集上述被调查者的 外周血进行甲基化及 mRNA 的检测。皮肤标本来自 15 例对照 （某医院手术时采集并保存的正常皮肤 ） 和 61 例患者 （自愿手术 治疗砷中毒患者 ） ， 根据其病理形态学， 34 例患者为一般病变组 （包括色素增多、皮炎和角化过度等 ） 、 21 例患者为癌前病变组 （包括不典型增生、 皮角及经久不愈溃疡） 及 6 例患者为癌变组 （包括 Bowen’ s 病、 基底细胞癌和鳞状上皮细胞癌 ） ， 皮肤标本检 测蛋白表达。既有皮肤组织又有血液标本的患者为 40 例。 1.2主要仪器及试剂 核酸蛋白分析仪 （Amersham 公司） ， MyiQ Real Time PCR 仪 （Bio-Rad 公司） ， Mastercycle gradient 型 PCR 扩增仪 （Eppendorf 公司 ） ， 电泳仪 （北京六一仪器厂 ） ， 光学显微镜 （Olympus 公司） 。 PrimeScriptTMRT reagent Kit （Takara 公司） ， SYBR Premix Ex TaqTMII （Takara 公司） ， 浓缩型鼠抗人 MGMT 单克隆抗体 （Santa Cruz 公司） ， 浓缩型鼠抗人 DNMT1 单克隆抗体 （Abcam 公司） ， PV-9000 二步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限 公司 ） ， 浓缩型 DAB 试剂盒 （北京中杉金桥生物技术有限公司 ） 。 1.3MGMT 基因启动子区甲基化的检测 用甲基化特异性 PCR 检测外周血淋巴细胞 MGMT 基因启 动子区甲基化。淋巴细胞分离液常规分离淋巴细胞， 酚-氯仿抽 提基因组 DNA， 并进行亚硫酸盐修饰， 参照文献设计引物[13]。 甲基化引物序列 （扩增片段为 81 bp ） 上游 5′-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3′ 下游 5′-GCACTCTTCCGAAAACGA AACG-3′ 非甲基化引物序列 （扩增片段为 93 bp ） 上游 5′-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′ 下游 5′-AACTCCACA CTCTTCCAAAAACAAAACA-3′ 反应条件为预变性 95 ℃ 5 min， 94 ℃ 变性 45 s， 59 ℃ （非 甲基化） /56 ℃ （甲基化） 退火 45 s， 72 ℃延伸 45 s，共 35 个循 环， 最后于 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物进行 8聚丙烯酰胺凝 胶电泳， 硝酸银染色观察结果。以 M-Sss-Ⅰ处理的胎盘 DNA 为 阳性对照， 无菌双蒸水代替模板作为阴性对照。 仅非甲基化引物 扩增出条带判断为甲基化阴性；仅甲基化引物扩增出条带为完 全甲基化，甲基化与非甲基化引物都扩增出条带为不完全甲基 化， 二者均判断为甲基化阳性。 1.4外周血淋巴细胞中 MGMT 及 DNMT1 mRNA 表达的实时 荧光定量PCR检测 以常规 Trizol 提取总 RNA， 随即用 PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆转录成 cDNA。以 Primer Premier 5.0 软件设计引物。 MGMT （NM_002412 ） 引物序列 （113 bp ） 如下 上游 5′-CAGCCCGAGGCTATCGAAGA-3′ 下游 5′-CCGAATTTCACAACCTTCAGCA-3′ DNMT1 （NM_001379 ） 引物序列 （127 bp ） 如下 上游 5′-ATTGATGCGGAAACCCTGGA-3′ 下游 5′-CGTGAAACATCTGCCCGTTG-3′ 内参 β-actin （NM_001101 ） 引物序列 （186 bp ） 如下 上游 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′ 下游 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′ 以 SYBR Premix Ex TaqTMII 进行实时荧光定量 PCR，反应 条件为预变性 95 ℃ 1 min， 95 ℃ 变性 15 s， 62 ℃ （MGMT ） /60 ℃ （DNMT1 ） /54 ℃β-actin 退火 15 s， 72 ℃延伸 15 s 共 40 个循环， 扩增完毕后进行熔解曲线分析。每个标本重复 3 次。目标基因 mRNA 的相对表达量采用 Bio-Rad iQ 5 软件根据其 Ct 值用内参 校正后计算获得。 1.5皮肤 MGMT 及 DNMT1 蛋白表达的免疫组织化学法检测 砷中毒患者皮肤石蜡标本 4 μm 连续切片，常规二甲苯脱 蜡 10 min 3 次， 梯度乙醇水化， 1 mmol/L EDTA （pH8.0 ） 高压抗 原修复， 3％过氧化氢孵育 10 min 以阻断内源性过氧化物酶， 滴 加一抗 （MGMT 稀释比 1∶50； DNMT1 稀释比 1∶30 ） 约 50 μl， 4 ℃ 孵育过夜。 滴加 PV-9000 聚合物辅助剂， 37 ℃孵育 20 min 后， 滴 加辣根酶标记羊抗兔/小鼠 IgG 多聚体， 37 ℃孵育 30 min。DAB 显色， 苏木素复染， 盐酸乙醇分化， 脱水透明后中性树脂封片。 以 PBS 代替一抗作为空白对照， 分别用 MGMT 和 DNMT1 阳性 表达组织作为阳性对照。MGMT 和 DNMT1 蛋白为细胞核阳性 表达， 结果判断[14,15] 光镜下随机观察 5 个高倍视野， 每个视野 计数 100 个细胞， 根据阳性细胞所占百分数计分 阳性细胞率 ＜5％为 0 分， 5％～25％为 1 分， 26％～50％为 2 分， 51％～75％为 3分， ＞75％为 4 分； 同时再根据阳性细胞染色强度计分 无着色为 0分， 淡黄色为 1 分， 棕黄色为 2 分， 棕褐色为 3 分； 根据两者相 加所得的总分进行结果判断 0～1 分为阴性- ， 2～3 分为弱阳性 （ ） ， 4～5 分为中度阳性 （ ） ， 6～7 分为强阳性 （ ） 。 1.6统计学分析 采用 SPSS 13.0 统计软件对实验数据进行分析。甲基化数 据进行 χ2和趋势 χ2检验；实时荧光定量检测 mRNA 相对表达 量原始数据进行正弦函数变量变换，变换后数据处理采用单因 素方差分析和独立样本 t 检验；免疫组化检测蛋白表达数据进 行 Kruskal-Wallis H 检验和 Mann-Whitney U 检验，相关分析采 用 Spearman 等级相关。P0.05 有统计学意义。 2结果 2.1砷中毒患者外周血淋巴细胞中 MGMT 基因启动子区甲基化 轻、 中、 重度砷中毒组患者外周血中 MGMT 基因启动子区甲 基化阳性率分别为 25.00， 39.29和 56.25，均高于对照组 （4.35 ） ， 差异有统计学意义 （χ213.976， P0.01 ） 。且 MGMT 基因 启动子区甲基化阳性率随着砷中毒程度的加重而升高 （χ213.739， 284 环境与健康杂志 2010 年 4 月第 27 卷第 4 期J Environ Health, April 2010, Vol．27, No．4 P0.01 ） ， 见表 1、 图 1。 2.2砷中毒患者外周血淋巴细胞中MGMT、 DNMT1 mRNA 的表达 轻、 中、 重度砷中毒组患者 MGMT mRNA 表达的平均值分 别为 0.240 650.682 66、 0.080 260.893 04 和 0.021 240.887 33， 与对照组（0.225 540.878 47 ） 比较，差异无统计学意义（F 0.419, P＞0.05 ） ； 轻、 中度砷中毒组患者 DNMT1 mRNA 表达的平 均值分别为 0.221 830.595 09 和 0.246 110.509 79，明显低于 对照组 （0.695950.46398 ） ， 差异有统计学意义 （F4.013， P＜0.01 ） 。 但重度组 （0.389 270.411 33 ） 与对照组差异无统计学意义。见 表 2。 砷中毒患者及对照人群按 MGMT 基因启动子区甲基化检 测结果分为甲基化组和非甲基化组， 则 MGMT mRNA 表达的平 均值分别为 0.201 360.795 62 和 0.017 100.854 89，差异无统 计学意义（t1.269, P＞0.05 ） ； DNMT1 mRNA 表达的平均值分别 为 0.399 760.581 38 和 0.351 600.376 10，差异无统计学意义 （t0.370, P＞0.05 ） 。见表 3。 2.3砷中毒患者皮肤组织中 MGMT 及 DNMT1 蛋白的表达 MGMT 阳性蛋白表达于细胞核 （封三图 2 ） ， 对照组和一般 病变组皮肤组织中 MGMT 阳性表达率分别为 100和 97.06 （33/34 ） ， 以中度阳性和强阳性表达为主； 癌前病变组阳性表达 率为 90.48 （19/21 ） ， 以中度阳性和弱阳性表达为主； 癌变组阳 性表达率为 66.67 （4/6 ） ， 以弱阳性和不表达为主。多组间比较 差异有统计学意义 （χ218.258， P0.01 ） ， 癌前病变组和癌变组分 别与对照组比较， 差异有统计学意义 （P0.01 ） ， 见表 4。皮肤病 损程度与 MGMT 蛋白表达强度等级作相关分析， Spearman 相关 系数 （rs） 为-0.446 （P0.01 ） ， 即随着砷中毒患者皮肤损害程度加 重， MGMT 蛋白表达逐渐减弱。 DNMT1 蛋白在正常皮肤组织中未见表达， 在砷中毒病变皮 肤中开始出现阳性表达， 阳性染色仅见于细胞核 （封三图 3 ） 。 一 般病变组阳性表达率为 88.24 （30/34 ） ，以弱阳性和中度阳性 表达为主； 癌前病变组阳性表达率为 100， 以阳性表达为主； 癌变组阳性表达率为 100， 以强阳性表达为主。多组间比较， 差异有统计学意义 （χ243.935， P0.01 ） ， 一般病变组、 癌前病变 组和癌变组分别与对照组比较， 差异均有统计学意义 （P0.01 ） ， 见表 4。皮肤病损程度与 DNMT1 蛋白表达强度等级作相关分 析， Spearman 相关系数 （rs） 为 0.740 （P0.01 ） ， 即随着砷中毒患者 皮肤损害程度加重， DNMT1 蛋白表达逐渐增强。MGMT 蛋白与 DNMT1 蛋白表达强度作相关分析， Spearman 相关系数 （rs） 为 -0.232 （P0.05 ） ， 即随着 DNMT1 蛋白表达增强， MGMT 蛋白表 达逐渐减弱。 将既有皮肤组织又有血液标本的 40 例患者按 MGMT 基因 启动子区甲基化检测结果分为甲基化组和非甲基化组， MGMT 蛋白在甲基化组中表达较非甲基化组减弱 （P0.05 ） ， 而 DNMT1 蛋白在甲基化组中表达较非甲基化组增强 （P0.05 ） ， 见表 5。 3讨论 环境砷污染是一个严重的公共卫生问题，特别是长期低浓 度砷暴露引起的慢性地方性砷中毒在全世界分布广泛、涉及面 表 1砷中毒患者中外周血淋巴细胞中 MGMT 基因 启动子区甲基化情况 组别 对照组 轻度砷中毒组 中度砷中毒组 重度砷中毒组 注 * 经 χ2检验， 与对照组比较， P0.01。 人数 23 24 28 16 阳性例数 1 6 11 9 阳性率 （ ） 4.35 25.00* 39.29* 56.25* 表 3MGMT 基因甲基化和非甲基化人群外周血淋巴细胞中 MGMT、 DNMT1 mRNA 的表达 MGMT 基因甲基化组 MGMT 基因非甲基化组 27 64 MGMT mRNA 相对表达量 0.201 360.795 62 0.017 100.854 89 DNMT1mRNA 相对表达量 0.399 760.581 38 0.351 600.376 10 人数组别 （xs ） 表 4不同病理改变砷中毒患者皮肤组织中 MGMT、 DNMT1 蛋白的表达 对照组 一般病变组 癌前病变组 癌变组 注 * 变量秩变换后 Dunnett 两两比较， 与对照组比较， P0.01。 15 34 21 6 - 0 1 2 2 1 4 6 3 9 22 12 1 5 7 1* 0* - 15 4 0 0 0 15 4 0 0 12 12 2 0 3* 5* 4* MGMT 蛋白表达DNMT1 蛋白表达 人数组别 表 5MGMT 基因甲基化和非甲基化砷中毒患者皮肤组织中 MGMT、 DNMT1 蛋白的表达 MGMT 基因甲基化组 MGMT 基因非甲基化组 注 * 与非甲基化组比较， 经 Mann-Whitney U 检验， P0.05。 17 23 - 2 0 5 2 9 16 1* 5 - 0 2 4 11 7 6 6* 4 MGMT 蛋白表达DNMT1 蛋白表达 人数组别 图 1MGMT 基因启动子区甲基化检测 PCR 产物 聚丙烯酰胺凝胶电泳图 Mmarker； 1甲基化阳性标本 A 的非甲基化扩增条带； 2， 4甲基化 阳性标本 A、 B 的甲基化扩增条带； 3甲基化阳性标本 B 非甲基化扩 增无条带； 5甲基化阴性标本 C 的非甲基化扩增条带； 6甲基化阴性 标本 C 甲基化扩增无条带； 7阳性对照非甲基化扩增无条带； 8阳性 对照甲基化扩增条带； 9双蒸水对照非甲基化扩增无条带； 10双蒸 水对照甲基化扩增无条带 110 bp 89 bp M12345678910 表 2砷中毒患者外周血淋巴细胞中 MGMT、 DNMT1 mRNA 的表达 对照组 轻度砷中毒组 中度砷中毒组 重度砷中毒组 注 *LSD-t 检验， 与对照组比较， P0.01。 23 24 28 16 MGMT mRNA 相对表达量 0.225 540.878 47 0.240 650.682 66 0.080 260.893 04 0.021 240.887 33 DNMT1mRNA 相对表达量 0.695 950.463 98 0.221 830.595 09* 0.246 110.509 79* 0.389 270.411 33 人数组别 （xs ） 285 环境与健康杂志 2010 年 4 月第 27 卷第 4 期J Environ Health, April 2010, Vol．27, No．4 大， 预防和控制受到各国政府广泛关注， 但其致病或致癌机制不 清成为制约其防控的瓶颈问题之一，故对砷中毒致病或致癌机 制的研究一直是该领域的重点和热点。 随着肿瘤研究的进展， 人 们逐渐认识到砷暴露对细胞 DNA 甲基化状态、 基因表达存在不 同方式的表观遗传学影响。DNA 甲基化是在 DNA 甲基转移酶 （DNMTs ） 的作用下， 由 S-腺苷甲硫氨酸提供甲基基团， 将 CpG 二核苷酸的胞嘧啶甲基化为 5-甲基胞嘧啶。 DNA 甲基化包括重 新甲基化和维持甲基化， DNA 甲基转移酶 1 （DNMT1 ） 参与 DNA 维持甲基化修饰的过程。 CpG 位点甲基化后将与甲基化 CpG 结 合蛋白形成复合物，从而直接阻断转录因子与基因调控序列的 结合， 或通过组蛋白去乙酰化酶 （HDAC ） 使组蛋白去乙酰化， 导 致核小体聚集， 从而抑制基因的转录。 MGMT 是一种高效的 DNA 修复酶，仅需一步反应就能将 O6-烷基鸟嘌呤上的烷化基团共价转移到自身的半胱氨酸残基 上， 使 DNA 上损伤的鸟嘌呤复原。 启动子区甲基化调控的MGMT 基因表观沉默是人类肿瘤发生的一个重要突变路径[16]。本研究 发现患者皮肤组织中 MGMT蛋白随着砷中毒患者皮肤损害程度 加重其表达逐渐减弱， 进一步分析发现， MGMT 基因启动子区高 甲基化抑制了患者皮肤组织中 MGMT蛋白的表达。但在不同病 情及 MGMT 启动子区不同甲基化状态的砷中毒患者外周血中， MGMT mRNA 的表达差异无显著性， 提示 MGMT 表达变化主要 是在砷中毒患者病变组织中，对砷中毒患者病变皮肤组织中的 MGMT 蛋白检测更有意义。 研究报道[17-20]， DNMT1 蛋白的高表达可使肿瘤组织中 DNA 甲基化修饰率显著提高， 而发生在抑癌基因启动子区域 CpG 岛 的高甲基化修饰可致该基因沉默， 从而导致肿瘤的发生。 本研究 发现在 DNA 甲基化过程中起关键作用的 DNMT1 蛋白随着砷 中毒患者皮肤损害程度加重， 其表达逐渐增强， 并与 MGMT蛋白 表达呈负相关，同时与 MGMT 基因启动子区甲基化程度相一 致， 即 MGMT 基因启动子区甲基化患者中 DNMT1 蛋白高表达。 但在轻、中度砷中毒患者外周血中 DNMT1 mRNA 的表达低于 对照人群， 与 MGMT 基因启动子区甲基化程度也未显示出相关 性，这与 DNMT1 蛋白在砷中毒患者皮肤组织中表达情况不尽 一致。 是由于 mRNA 在组织和外周血中表达水平有所不同还是 另有原因本课题组将进行后续研究。 DNA 甲基化通过影响基因突变、 基因表达调控、 基因组稳 定性等在肿瘤的发生和演进过程中扮演着重要角色[21-23]。 而DNA 甲基化在本质上的可逆性，也为肿瘤的防治提供了新的思路和 机会。本研究充分利用我省燃煤砷暴露的病区资源， 可为揭示砷 致病或致癌机制积累更直接可靠的资料， 但同时也存在人群研究 的局限性， 如观察对象及其生物材料获取的困难、 混杂因素的影 响以及暴露剂量难以准确定量等。 为此， 课题组在此实验基础上， 将在细胞水平来进一步验证砷所致 MGMT 基因启动子区甲基化 对其转录及表达调控的抑制作用。而 MGMT 基因有着较强的应 用价值，检测 MGMT 基因启动子的异常甲基化可作为肿瘤早期 诊断、 判断肿瘤分期的指标[24,25]， 同时 MGMT 基因又是目前唯一发 现的肿瘤对烷基化药物耐药的相关基因，目前一种通过检测肿 瘤细胞中 MGMT 基因甲基化或 MGMT蛋白的表达来进行肿瘤 个性化化疗的方案引人关注[26,27]。对 MGMT 基因的研究可能会 为砷中毒乃至砷所致肿瘤的防治提供一个重要的靶点和方向。 （衷心感谢中国人民解放军第 44 医院董学新、 岑笃才、 张碧霞以及 贵阳医学院梁冰、 杨斌、 姚茂琳对本研究的帮助与支持 ） 参考文献 ［1］International Agency Research on Cencer IARC. 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