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热区高效石油降解菌降解性能的研究 * 陈凯靳冰冰姚明庆王运林周海龙刁晓平 海南大学农学院， 海口 570228 摘要 通过降解成分的差异性筛选混合菌， 并分析混合菌对石油的降解效率及性能。以原油、 正十六烷和多环芳烃 萘、 菲、 蒽、 芘按 10∶ 1∶1∶1混合 为碳源， 从海口近海岸表层 10 ～20 cm 沉积物中分离纯化出 4 株降解效率较高的菌 种， 经染色镜检和分子生物学鉴定， 分别是曲霉属 Aspergillus 、 希瓦氏菌属 Shewanella 、 芽孢杆菌属 Bacillus 和毕 赤酵母属 Pichia 。结果表明 4 种菌等比例混合构建的混合菌在第 9 天的原油最大降解效率 89. 80 高于单菌株 曲霉属 48. 24 。分离得到的菌株具有降解多种石油成分的能力， 混合菌中真菌与细菌可能存在协同作用。 关键词 高效石油降解菌; 丝状真菌; 混合菌构建; 协同作用 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201407015 DEGＲADATION PEＲFOＲMANCES AND SCＲEENING OF HIGHLY EFFICIENT PETＲOLEUM DEGＲADING BACTEＲIA Chen KaiJin BingbingYao MingqingWang YunlinZhou HailongDiao Xiaoping College of Agricultural，Hainan University，Haikou 570228，China AbstractBy screening the mixed bacteria through the difference of degradation compounds，degradation efficiency of petroleum and perances were studied． Four highly efficient petroleum degrading bacteria which were isolated and purified from surface sediments 10 ～ 20 cmnear the coast of Haikou with crude oil，n- hexadecane and polycyclic aromatic hydrocarbons including naphthalene，phenanthrene，anthracene，pyrene by 10∶ 1∶ 1∶ 1 mixtureas the sole carbon source respectively，identified as Aspergillus，Shewanella，Bacillus and Pichia based on their staining microscopes and molecular biology identifications． The results showed that the ninth day of the maximum removal efficiency of crude oil by the four mixed bacteria 89. 80at an equal ratio was higher than the single strain 48. 24of the genus Aspergillus． It was also showed that the isolated strains had the ability to degrade various oil compositions，there may exist a synergistic effect between fungi and bacteria． Keywordshighly efficient petroleum- degrading bacteria;filamentous fungi;construction of mixed bacteria;synergistic effect * 国家级大学生创新训练项目 201210589001 ; 海南大学 2012 年本科 生创 新 基 金 项 目 HDCX2012031 ;教 育 部 博 士 点 基 金 20114601120001 。 收稿日期 2013 －09 －12 0引言 石油是重要的能源物质， 然而石油泄漏已成为危 害海洋生态环境的最大污染源之一［1 ］。生物修复技 术是治理石油污染的重要方法， 被认为是高效、 低成 本、 环境友好型的污染治理技术。一些能够降解海洋 石油的微生物已经被分离， 其中细菌包括不动杆菌 属、 芽孢杆菌属、 假单胞菌属等 40 个属; 真菌中金色 担子菌属、 假丝酵母属、 红酵母属和掷孢酵母属是最 常见菌种， 此外还包括一些丝状真菌如曲霉属、 镰刀 霉属等 ［2 ］。 环境中石油降解过程往往是多种菌协同作用的 结果， 混合菌的降解效率高于单株菌［3- 4 ］。Ｒichard 等 以柴油为碳源富集得到混合菌系对柴油的降解率达 90［5 ］。崔爱玲等发现由 7 种单菌株组成的混合菌 对石油烃的降解最彻底， 除了姥鲛烷和植烷没有被降 解外， 其余的烷烃几乎全部被分解［6 ］。构建混合菌 的方法， 大都是将纯化后的菌株再重新组合成新的混 合菌 ［7 ］， 并且随机组合， 有部分倾向于等比例混合， 还有是通过正交试验把具有协同作用的菌混合等。 混合菌间的生理生化和遗传协同机制有待研究。 36 水污染防治 Water Pollution Control 目前， 针对混合菌降解海洋中石油的研究还比较 缺乏， 已有的研究主要针对土壤中的石油污染或是海 水中多环芳烃 PAHs 的生物降解。因此， 本实验旨 在从海水中筛选分离出多种对石油不同组分具有特 异降解功能的菌株， 通过降解成分的差异性筛选混合 菌， 为深入研究混合菌的协同作用机制， 高效石油降 解菌群的构建以及治理海洋石油类污染提供科学 依据。 1实验部分 1. 1材料 1. 1. 1药品与仪器 药品 原油来自海南澄迈福山油田。正十六烷、 石油醚、 丙酮、 菲、 萘等均为分析纯。 仪器 UV/VIS Lambda 紫外 － 可见光分光光度计 PerkinElmer 公司 等。 1. 1. 2实验样品 采自海南省海口市 5 个不同地点的近海岸表层 10 ～20 cm 沉积物。 1. 1. 3培养基 主要包括 1 普通培养基 ［ 8 ］; 2 筛选培养基［ 9 ］等。 1. 2方法 1. 2. 1原油的预处理 原油置于90 ℃水浴锅恒温加热 2. 5 h 后， 用石油 醚溶解过滤。石油醚在通风橱中完全挥发后， 以丙酮 配制成1的石油溶液， 灭菌后4 ℃冰箱保存备用。 1. 2. 2降解菌株的分离与筛选 分别称取 5 个不同地点的 10 g 样品加到 90 mL 无菌水中， 通过震荡、 静置后， 取上清分别加到以原 油、 正十六烷和 PAHs 为碳源的筛选培养基中， 在摇 床上振荡培养。5 d 后观察培养液浑浊度及特征， 并 分别取5 mL 培养液接入新鲜的三种不同碳源培养基 中， 相同条件下培养 5 d， 重复3 次。然后在普通固体 培养基上划线分离， 纯化后接种于普通固体培养基， 4 ℃保存备用。 1. 2. 3降解菌株的鉴定 1 镜检。参考沈萍等主编的微生物学实验 第 四版 ［10 ］。 2 分子生物学鉴定及序列分析。本实验的分子 生物学测序鉴定工作由上海生工生物工程股份有限 公司完成。 1. 2. 4单菌株对原油不同组分的降解 单菌株在 28 ℃、 170 r/min 普通液体培养基中振 荡培养至指数增长后期。室温下收集菌体， 用无碳源 的筛选培养基洗涤两次后悬浮于其中， 制成菌悬液。 取5 mL 接到95 mL 以正十六烷、 PAHs 或原油为唯一 碳源的筛选培养基中。培养并定时取样测定 OD600的 吸收值， 同时测定原油的降解率， 以未接种菌液的培 养基作为对照。每组实验重复 3 次。 1. 2. 5混合菌对原油的降解 依据各单菌株降解原油的组分和特性， 分别从原 油、 正十六烷和 PAHs 为唯一碳源培养基上筛选出的 不同菌种按 1∶ 1∶ 1 细胞总数 比例构建混合菌群， 制 成菌悬液接种到以原油为唯一碳源的筛选培养基中 培养， 定时取样测定原油的降解率。同时， 以未接种 菌液的相同培养基作为对照， 每组实验重复 3 次。 1. 2. 6原油降解率的测定 采用紫外分光光度法［11 ］测定实验菌株对原油的 降解率。原油降解率 η 计算如下 η w0－ wx / w0 100 式中 w0表示对照组中残余原油含量;wx 表示各测 试样品的残余原油含量。 2结果与分析 2. 1降解菌株的分离与鉴定 通过不同碳源培养基的筛选， 分离得到 7 种菌 株， 其中 4 种生长状况较优且降解能力较强， 对其降 解效率进行重点研究。经染色镜检观察和分子生物 学鉴定， 其菌落形态与个体特征如表 1 所示。4 种菌 株中， JYY- 4 丝状真菌为曲霉属 Aspergillus ， JP- 2 是 毕赤酵母属 Pichia ， 其他 2 种是细菌。4 种菌最佳 生长条件相似， 降解石油的最适温度为 27 ～30 ℃， 染 色镜检结果如图 1 所示。JYY- 4 分生孢子梗由一根 直立的菌丝形成， 菌丝中无隔膜， 菌丝的末端形成球 状膨胀 顶囊并被染成蓝色， 经鉴定为曲霉属 Aspergillus 。JP- 2 以链状方式排列， 形体比 JP- 1 和 H- 1 大， 端处有未被染色的区域， 推测为内生孢子。 2. 2单菌株对原油不同组分的降解 利用紫外分光光度法， 分析 H- 1 对正十六烷、 JP- 1 与 JP- 2 对 PAHs 的降解性能研究， 为进一步复合菌的 降解性能打下基础。 2. 2. 1H- 1 对正十六烷的降解 图 2 为 H- 1 以正十六烷为唯一碳源液体培养基 中的生长曲线， 根据 H- 1 的生长状况可以间接反映出 H- 1 对正十六烷的降解情况。 降解正十六烷的摇瓶实验中， 培养液表层有大量 46 环境工程 Environmental Engineering 表 1 4 种菌株的菌落形态与个体特征 Table 1Colony morphology and individual characteristics of four strains 菌株筛选碳源菌落特征菌体形态种属 JYY- 4原油黄色， 质地疏松， 干燥， 不透明孢子和细长菌丝曲霉属 Aspergillus H- 1正十六烷金黄色， 透明， 圆形， 湿润短杆状希瓦氏菌属 Shewanella JP- 1多环芳烃淡黄色， 半透明， 圆形， 湿润长直杆状芽孢杆菌属 Bacillus JP- 2多环芳烃乳白色， 半透明， 圆形， 湿润长杆状毕赤酵母属 Pichia aJYY- 4;bH- 1;cJP- 1;dJP- 2． 图 14 种菌株的染色镜检结果图400 Fig． 1The staining microscopy results of four strains 400 图 2 H- 1 降解正十六烷的生长曲线 Fig．2Degradation of n- hexadecane growth curve by H- 1 乳化液产生， 这可能是因为菌株分泌产生了生物表面 活性物质。细菌分泌的生物表面活性物质比化学表 面活性剂在加强乳化、 溶解原油和 PAHs 方面更加有 效 ［12- 13 ］。随后黄色球状悬浮物逐渐转变成黄色颗粒 物并沉于瓶底， H- 1 能够利用和降解十六烷， 随着 H- 1 细菌数量的增加， 培养液中十六烷含量逐渐减少。 2. 2. 2JP- 1 与 JP- 2 对 PAHs 的降解 JP- 1 与 JP- 2 两种菌在以 PAHs 为唯一碳源液体 培养基中的生长曲线如图 3 所示。两种菌在第 7 天 都有最大的 OD600值， 且 JP- 1 明显高于 JP- 2， 说明JP- 1 菌种的生物量更多， 反映出 JP- 1 降解 PAHs 的能力大 于 JP- 2。 2. 3紫外分光光度法测定原油含量的标准曲线 紫外分光光度法测定原油含量的标准曲线如 图 4所示。在波长为 235 nm 处， 标准油样的紫外吸 收值与所含原油浓度呈较高的线性关系 Ｒ2 0. 9909 ， 依据该标准曲线可计算样品中原油残余量。 图 3 JP- 1 与 JP- 2 降解 PAHs 的生长曲线比较 Fig．3Degradation of PAHs growth curve by JP- 1 compared with JP- 2 图 4标准曲线 Fig．4The standard curve 2. 4混合菌与 JYY- 4 降解原油的效率比较 在单菌降解性能分析的基础上， 对 4 种单菌组成 的混合菌进行研究。4 种不同菌株等比例构建的混 合菌与 JYY- 4 单菌降解原油的效率比较如图 5 所示。 在培养的 9 d 时间里， 降解效率逐渐增大， 其中混合 56 水污染防治 Water Pollution Control 菌在第 9 天的最大降解效率为 89. 80， 比 JYY- 4 48. 24 高 41. 56， 表明多种菌种的协同作用效 果优于单一菌株。无论是混合菌还是 JYY- 4， 在接种 后的 4 d 内降解效率增长较快。丝状真菌对原油的 生物转化作用是生物吸咐和生物降解相结合的过 程 ［14 ］， 初始阶段 JYY- 4 的菌丝大量萌发并吸附原油， 导致培养液中的原油含量迅速降低。 图 5 JYY- 4 和混合菌群降解原油效率比较 Fig．5Degradation efficiency of crude oil by JYY- 4 and Mixture 2. 5混合菌中不同菌种的相互作用 JYY- 4 单菌降解原油实验中， 没有出现接种混合 菌后产生的黄色带状不溶物， 而是出现大量的絮状漂 浮物， 这与韩慧龙等 ［15 ］研究发现在真菌和细菌混合 培养体系中， 真菌和细菌数量显著增加的结论一致。 同时， 混合菌降解原油的效率 89. 80 明显高于单 菌株 JYY- 4 的降解效率 48. 24 。这表明本实验 构建的混合菌中真菌与细菌可能存在协同作用。协 同作用机理还有待进一步深入研究。真菌在代谢石 油烃过程中产生大量胞外酶能促进其对石油烃中难 降解物质以及细菌降解所产生的高分子量、 结构复杂 代谢中间产物的降解［16 ］。 通过降解实验发现， JP- 1、 JP- 2 不但能降解多环 芳烃， 也能降解正十六烷; JYY- 4 能降解十六烷、 多环 芳烃和原油其他组分， 且 JYY- 4 降解原油的效率比其 他 3 种菌株都高， 这与丝状真菌在降解原油方面比细 菌有优势的结论一致［17- 18 ］。同时， 相似的生长条件 和降解范围也表明， 这几种菌株存在相似的碳源或能 量来源， 对原油多种组分的降解能力对于石油降解混 合菌群的构建起促进作用。 3结论 通过对单菌株和复合菌株降解性能的比较研究， 可得出以下结论 1 通过筛选获得4 株降解能力较强的菌株， 经染 色镜检观察和分子生物学鉴定， 分别为曲霉属 Aspergillus 、 希瓦氏菌属 Shewanella 、 芽孢杆菌属 Bacillus 和毕赤酵母属 Pichia 。 2 4 种单菌均能降解原油的多种成分， 并且丝 状真菌 曲霉属 降解原油的效率高于其他 3 种 菌株。 3 通过混合菌的原油降解实验发现 丝状真菌 与细菌数量显著增加， 且降解效率明显提高， 表明混 合菌中真菌与细菌存在协同作用。 参考文献 ［1］Cappello S，Denaro Ｒ，Genovese M，et al． Predominant growth of Alcanivorax during experiments on “oil spill bioremediation”in mesocosms［J］． Microbiological Ｒesearch， 2007， 162 185- 190． ［2］李丽，张利平，张元亮． 石油烃类化合物降解菌的研究概况 ［J］． 微生物学通报， 2001， 28 5 89- 92． ［3］KomukaiNS， SugiuraK， YamauchiInomataY， etal． Construction of bacterial consortia that degrade Arabian light crude oil ［J］．Journal of Fermentation 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O3/H2O2氧化法处理石化废水的反应体系 进行一级反应动力学拟合得出 O3/H2O2氧化法对 COD 去除符合一级反应动力学方程， 反应速率常数 为 0. 0283 min －1。 参考文献 ［1］ShilpiVerma， BasheshwarPrasad， IndraManiMishra． Thermochemical treatment thermolysisof petrochemical wastewater COD removal mechanism and floc ation ［J］． Industrial and Engineering Chemistry Ｒesearch， 2011， 50 9 5352- 5359. ［2］何士龙， 高迎新， 杨敏， 等． Fenton 氧化法用于低可生化性石化 废水预处理的研究［J］． 北京化工大学学报． 自然科学版， 2009， 36 3 87- 90. ［3］彭人勇， 杨秀娟． O3/H2O2预处理某制药厂嘧啶废水的研究 ［J］． 工业水处理， 2010， 30 12 73- 76. ［4］Sutrasno Kartohardjono，Milasari Herdiana Putri，Sri Fahmiati， et al．Combination of ozonation process and absorption through membrane contactor using natural hot spring water as absorbent to remove ammonia from wastewater［J］． Journal of Environmental Science and Engineering， 2012 1 428- 433. ［5］国家环境保护总局． 水和废水监测分析方法［M］． 4 版． 北京 中国环境科学出版社， 2002 91- 283. ［6］王磊， 陈锦烽， 吕效平， 等． O3/H2O2处理水中 4， 4 － 二溴联苯 及其动力学研究［J］． 环境科学， 2007， 28 9 1998- 2002. ［7］姚玉婷， 李占臣． 臭氧 － 过氧化氢预处理 H 酸废水［J］． 工业用 水与废水， 2012， 43 1 24- 27. ［8］高伟杰， 曹国平， 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