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典型酚类废水的微生物处理研究现状及其进展 * 贺强礼关向杰黄水娥狄准杨海君 湖南农业大学生物安全科学技术学院， 长沙 410128 摘要 酚类是一种原生质的高毒物质， 严重危害人类的健康与生存。含酚废水来源广泛、 水质复杂、 总量较大， 因此必 须对含酚废水进行有效处理。微生物以其高效、 快速、 无二次污染等优点成为降解酚类污染物的首选对象。对微生物 降解酚类的生理生化机制和关键酶， 高效降酚菌株的分离筛选、 降解特性以及利用细胞固定化技术、 构建高效基因工 程菌等技术手段处理酚类污染物的研究等方面进行综述。 关键词 含酚废水; 微生物; 生物降解; 基因工程菌 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201403002 ＲESEAＲCH ACTUALITIES AND DEVELOPMENT ON MICＲOBIAL TＲEATMENT OF TYPICAL PHENOLIC WASTEWATEＲ He QiangliGuan XiangjieHuang ShuieDi ZhunYang Haijun College of Bio- safty Science ＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China AbstractPhenols is a protoplasm of highly toxic substances，seriously harms human health and survival． As wide variety of sources，complex water quality，a large amount of phenolic wastewater，so it is necessary to deal effectively with phenolic wastewater． Microorganism with its efficient，rapid，no secondary pollution has become the preferred methed for degradation of phenolic pollutants． It was summarized the microbial degradation of phenol in the physiological and biochemical mechanism and key enzymes，high efficient phenol- degrading strain screening，degradation characteristics，constructed by the immobilized cell technology and efficient gene engineering bacteria technique for treatment of phenolic pollutants research in this paper． Keywordsphenolic wastewater;microbe;biodegradation;genetic engineered bacterium * 长沙市科技局成果转化基金 41101009- 21 ; 湖南省科技计划 2010FJ3124 。 收稿日期 2013 －05 －20 0引言 酚类化合物是一类原生质毒物， 几乎对所有生物 均有毒杀作用， 尤其对人体神经系统危害较大。在当 今的工业生产和社会生活中， 主要生产使用的酚类化 合物有苯酚、 甲酚、 氨基酚、 硝基酚、 萘酚、 氯酚等， 其 中以苯酚、 氯酚、 甲酚的污染最为突出， 是饮用水等生 活用水中须严格控制的污染物质。长期饮用被酚污 染的水或吸入低浓度酚蒸汽将会引起长期累积性中 毒， 而饮用高浓度酚溶液、 吸入高浓度酚蒸汽则引起 急性中毒。水溶液中的酚可通过皮肤进入体内而引 起全身中毒， 含酚废水几乎可使水中生物全部死亡。 极微量的氯酚 μg/L 级水平 就会使饮用水和食物 产生异味 ［1 ］。高浓度含酚废水因导致农作物枯死、 甚至减产而不宜用于农田灌溉［2 ］。大部分酚类易溶 于水、 结构稳定并且难分解和转化， 使其在自然界中 不断积累， 给自然环境造成严重危害。 苯酚被广泛用于造纸、 炼焦、 炼油、 塑料、 纺织等 化工领域， 是该类企业生产废水中的主要污染物， 它 与水中溶解氯作用产生的氯代酚是一种毒性更强的 有机污染物。由于苯酚及其衍生物有毒且难降解， 其 在水环境中广泛分布， 已对生态环境造成损害， 同时 也严重的威胁着人类的生存与发展。因此， 美国环保 署把苯酚列入 129 种优先污染物和 65 种有毒污染物 之列， 中国也将苯酚列入环境优先处理的污染物“黑 名单” 之中 ［3 ］。 1降酚微生物的研究进展 目前对含酚废水的处理手段主要有两大类［4 ］， 6 环境工程 Environmental Engineering 利用物理或物化方法处理和生物处理方法。物理或 物化方法虽然操作较简单， 可处理高浓度含酚废水， 但运营成本较高， 处理不完全， 一般用于含酚废水的 前处理。另一类是生物处理方法， 其中活性污泥法是 最常用的处理手段。活性污泥法具有操作简单、 费用 较低、 处理条件温和、 处理效果好、 受气候条件影响 小、 二次污染较小等优点。过去对于高浓度含酚废水 高于 1 000 mg/L 一般利用物理回收的方法进行处 理， 现阶段可通过筛选高效菌株和构建基因工程菌来 降解高浓度 1 000 ～2 000 mg/L 的含酚废水。 2降酚微生物的主要类群 对于酚类物质降解的研究， 国内外均做了大量的 工作， 到目前为止已从长期受酚类物质污染的环境中 筛选鉴定出大量的降酚微生物。这些微生物主要包 括细菌和真菌两大类 其中细菌主要包括根瘤菌 Ｒhizobia 、醋 酸 钙 不 动 杆 菌 Acinetobacter calcoaceticus 、 假单胞菌 Pseudonomonas sp． 、 真养产 碱 杆 菌 Alcaligeneseutrophus 、粪 产 碱 杆 菌 Alcaligenes faecalis 、苍 白 杆 菌 属 Ochrobactrum sp． 、 芽孢杆菌 Bacillus 、 反硝化菌 Denitrifiying bacteria 、洋 葱 伯 克 霍 尔 德 氏 菌 Burkholderia cepacia 、 罗尔斯通氏菌 Ｒalstonia eutropha 、 红球菌 Ｒhodococcus 等; 真菌可分为丝状真菌类和酵母菌 类， 丝状真菌中典型的有镰刀菌 Fusarium 、 白腐真 菌 Phanerochaete 、 青 霉 菌 Penicillium 、 曲 霉 菌 Aspergillus 等， 已分离的酵母菌类有假丝酵母菌 Candida 、 麦芽糖假丝酵母 Candida maltosa 、 丝孢 酵母 菌 Trichosporon sp． 等。某 些 藻 类 Alga Ochromonas danica 也具有较好的降解酚类物质的能 力。 其 中 黄 孢 原 毛 平 革 菌 Phanerochate chrysosporium 是对氯代酚化合物具有非专一性降解 作用的真菌， 还可降解菲、 蒽等多环芳烃和多氯联苯 及其各种染料等 ［5 ］。此外， 关于酵母菌降解苯酚的 报道也较多， 利用热带假丝酵母降解苯酚可在 66 h 内使 2 000 mg/L 苯酚溶液完全降解［6 ］。 2. 1细菌类降酚微生物 苍白杆菌 Ochrobactrum 是众多降解苯酚微生 物中的一种， 但在目前报道的降酚菌中拥有相对较低 现实降酚能力。陈晓华等 ［7 ］筛选到一株苍白杆菌 CH10， 该菌生长和降解苯酚的最适条件为温度 30 ℃、 pH 7. 0、 接种量5下， 初始浓度为1 000 mg/L 的苯酚溶液可在 48 h 内降解 82. 2， 最大苯酚耐受 度为 1 300 mg/L。该菌株在苯酚中的生长动力学符 合 Andrews 模型， 与苯酚降解趋势相似， 而对苯酚的 降解动力学过程符合抑制型的 Haldane 模型。 Geng 等 ［8 ］从活性污泥中成功分离筛选到一株醋 酸钙不动杆菌 EDP3， 该菌可在含苯酚、 苯甲酸钠、 对 羟基苯甲酸、 苯乙酸、 苯、 乙苯、 苯甲醇等的芳香烃环 境中生长， 在最适温度 25 ℃ 时可降解苯酚浓度为 1 000 mg/L的含酚废水， 而且降解反应遵循 Monod 模 式。张菊等 ［9 ］经多次富集、 驯化、 筛选分离出一株芽 孢杆菌， 通过逐渐提高苯酚浓度的方法， 可使其对苯 酚的降解能力从 500 mg/L 提高到 1 800 mg/L， 在已 报道的降酚菌中拥有较高的降酚能力。在对该菌降 解苯酚速率和混菌发酵的研究中发现， PD2 菌株的生 长与苯酚降解基本同步， 且混菌降解苯酚在各方面都 优于纯菌株。 利用共代谢技术， 添加其他结构相似且易降解物 质， 可提高菌体对酚类物质的降解效果。许甜甜 等 ［10 ］分离到一株苯酚降解菌 Sphingobium sp. XTT- 3， 在添加 0. 2 g/L 酵母膏为共代谢基质时， 能较明显促 进该菌降解苯酚的效率。白静等 ［11 ］利用从天津市煤 气公司活性污泥中分离得到的粪产碱杆菌， 在最佳条 件下该菌最大降解苯酚浓度为1 600 mg/L， 间甲酚的 最大降解浓度为 250 mg/L。分别以苯酚、 间甲酚作 为菌体生长的唯一碳源和能源， 在初始苯酚浓度为 0 ～1 600 mg/L、 初始间甲酚浓度为 0 ～250 mg/L， 利 用 Haldane 模型分别研究了单底物的细胞生长和底 物降解动力学。 假单胞菌不仅能够高效降解苯酚类物质， 而且也 是最常见的降解氯酚类化合物的微生物， 不仅能降解 多种氯酚， 而且能降解氯苯、 多氯联苯、 硝基苯和多环 芳烃等近100 种有毒物质 ［ 12 ］。向述荣等［ 13 ］从炼油厂 排污费水中分离筛选到一株高效降解苯酚的假单胞菌 phen8， 结果表明菌株 phen8 能同时利用苯酚和葡萄 糖， 葡萄糖对菌体生长有利但对苯酚降解过程有抑制 作用。Kotresha 等 ［ 14 ］分离到一株可在 156 h 内降解苯 酚 浓 度 为 1 300 mg/L 的 含 酚 废 水 的 假 单 胞 菌 MTCC4996， 添加低浓度的葡萄糖和蛋白胨可有效增强 苯酚处理效果， 降解苯酚的速率与外加金属离子有关， 低浓度的 Fe、 Cu、 Pb、 Zn、 Mn、 Hg 能提高降解速率。 由于环境中的污染物组成成分复杂， 仅具有降解 单一有机污染物的微生物很难发挥其降解效能 ［15 ］， 在已报道的环境功能菌中， 适应复杂环境的降酚研究 7 水污染防治 Water Pollution Control 较少。付瑾等 ［16 ］自德兴铜矿筛选出一株对重金属 Cd2 有较强抗性的皮氏罗尔斯通氏菌 DX- T3- 01， 经 驯化发现该菌株同时对苯酚有较强降解能力。 2. 2真菌类降酚微生物 2. 2. 1丝状真菌类 黄孢原毛平革菌 Phanerochaete chrysosporium 是白 腐真菌的典型种， 能降解苯酚、 氯酚等多种芳烃化合 物。李慧蓉等 ［ 17 ］研究黄孢原毛平革菌 BKM- F- 1767 对 不同浓度五氯苯酚 PCP 的降解作用， 利用高效液相 色谱法测定该菌在 100 mg/L 的 PCP 共培养液中最高 可达到97 的降解率。以 95 乙醇为溶剂， 并添加 0. 1的吐温80 和浅层培养可有效提高降解率。 李济吾等 ［18 ］利用从实验室分离的一株镰刀菌 HJ01， 研究结果表明该菌可利用苯酚为唯一碳源生 长， 适量的外加蔗糖可促进 HJ01 生长及苯酚降解。 在初始 pH 为6. 0、 温度为30 ℃、 加入蔗糖3 g/L 的最 佳降解条件下， 质量浓度为 420 mg/L 苯酚废水经 HJ01 处理 4 d 后可使其中的苯酚完全降解。Santos 等 ［19 ］研究了镰刀菌、 青霉菌、 曲霉菌和粘束孢霉菌 4 种丝状真菌对苯酚的降解情况， 结果表明曲霉菌 FIB4、 AE2 和镰刀菌 FE11 耐受苯酚的能力最强， 可 在 10 mmol/L 苯酚浓度的环境中生存。 2. 2. 2酵母菌类 目前国内外对酵母菌降解苯酚的研究大多集中 于热带假丝酵母和皮状丝孢酵母， 一般能降解浓度为 1 000 mg/L 左右的苯酚。Ｒocha 等 ［20 ］从分离出一株 好氧降酚的热带假丝酵母菌， 该菌可在苯酚浓度为 500 mg/L 或 1 000 mg/L 的环境中生存， 该菌在处理 中期释放出大量的多糖以减轻高浓度苯酚的毒害作 用， 结果表明该菌既能高效降解苯酚， 还可作为一种 新型环保的表面活性剂。Ｒigo 等 ［21 ］从含酚工业废水 中分离出一株可处理 1 000 mg/L 苯酚的热带假丝酵 母菌， 并对其生长特性进行了动力学模拟分析， 结果 表明该菌生长的最佳参数为 μmax 0. 174/h， KS 11. 2 mg/L， Ki298 mg/L。Vallini 等［22 ］分离出一株 酵母菌， 在好氧环境中能以4- 壬基苯酚为唯一碳源和 能源进行生长和降解。该菌经 β- 氧化途径可使 4- 壬 基苯酚烷基链的末端氧化， 结果证明该酵母菌有新的 4- 壬基苯酚降解途径。 3固定化微生物细胞对酚类物质的降解 固定化技术用于废水处理具有一系列优点 在反 应器内保持高生物浓度， 反应启动快， 处理效率高， 操 作稳定， 产污泥量少， 固液分离简单， 对有毒物质的承 受能力和降解能力较游离细胞高。传统生物法处理 含酚废水主要存在污泥易膨胀， 微生物易流失与处理 效果不稳定等问题， 而选用海藻酸钙、 活性炭等载体 对优势菌进行固定化后， 可保持微生物的高活性与高 浓度， 显著提高酚类降解效率。Anselmo 等 ［23 ］比较了 琼脂、 海藻酸钙、 卡拉胶、 聚氨酯泡沫和聚丙烯酰胺等 不同载体固定化镰刀菌丝体， 在完全混合反应器中对 苯酚降解的不同效果。结果表明 固定化柔毛镰刀菌 降解苯酚的最高耐酚量可达 1 g/L。Chen 等 ［24 ］用聚 丙烯酰胺凝胶固定热带假丝酵母降解浓度为 1 000 ～ 5 000 mg/L 的苯酚， 5 ～10 d 可使初始浓度为4 000 ～ 5 000 mg/L 的苯酚达到 95的去除率。 4微生物降解酚类物质的机制和关键酶 国内外学者对酚类化合物的生物降解机制进行 较多研究， 特别是苯酚、 氯酚的降解机制、 代谢途径， 目前已有较为统一的认识。根据微生物对氧的需求 可将酚类降解途径分为好氧降解和厌氧降解。好氧 降解利用游离态氧作为最终电子受体， 而厌氧降解则 以氧除外的其他物质如硝酸盐、 硫酸盐、 二氧化碳或 铁等作为最终电子受体。微生物降解苯酚大多发生 在有氧条件下。在有氧条件下， 苯酚首先分解为邻苯 二酚， 邻苯二酚再由邻位和间位途径经环裂解， 最后 形成三羧酸循环中间物而被生物体用于自身代谢。 邻位和间位途径是两个独立的代谢系统， 邻位途径产 生 β- 酮基己二酸中间产物， 间位途径产生 α- 酮基己 二酸中间物 ［25- 26 ］。Tsai 等［27 ］从白色念珠菌 TL3 中分 离纯化出 CatA， 实验证明该酶有很高的耐酚能力和 高效降酚特性。 5降酚基因的研究 苯酚的降解基因一般成簇排列于大质粒或染色 体上。在好氧代谢途径中， 编码苯酚羟化酶的基因是 苯酚降解的关键基因， 该酶是苯酚降解途径的第一个 酶， 催化苯酚转变为邻苯二酚; 邻位和间位酶在将邻 苯二酚开环裂解为三羧酸 TCA 产物的过程起至关 重要的作用。邻苯二酚进一步的降解分为不同的途 径和代谢酶系统 C230 催化间位裂解或者由 CatA 催 化邻位裂解。这两类双加氧酶分别由 C230 和 CatA 相对应的基因编码， 它们在已报道的不同降酚菌中具 有高度的保守性［28 ］。Basile 等 ［29 ］使用功能性基因分 析技术定量分析生物反应器中苯酚羟化酶的多样性， 从驯化后的活性污泥中提取 DNA 基因组， 用于大亚 8 环境工程 Environmental Engineering 基苯酚羟化酶 LmPH 基因的片段扩增以获得 DNA 克隆文库。经系统发育分析和长时间实时 PCＲ 分析 发现 LmPH 基因拷贝总数基本上保持稳定， 但在不稳 定的苯酚污泥中， 苯酚降解效果发生显著变化的同时 也增加了 LmPH 基因的多样性， 这表明活性污泥中苯 酚降解效率的高低与共生环境中其他物种的生长特 性有一定联系。 6展望 酚类物质作为一种高毒物质， 对于高浓度含酚废 水仅运用单一的生物学研究和处理， 远达不到处理标 准， 如何提高微生物降解的处理效率和工程菌的稳定 性是现阶段需要解决的一大难题。 传统的苯酚降解菌的筛选主要依靠富集培养技 术， 但因选择效率低和不能正确反映代谢类型多样性 而限制了该技术的进一步发展。为了克服该技术的 不足， 人们已通过多种技术从环境样品中直接检测和 分离生物降解菌， 如利用放射自显影技术从油泥中直 接分离到苯甲酸降解菌和利用血清法从炼油废水活 性污泥中分离苯酚降解菌等。有报道称利用多组分 苯酚羟化酶基因保守序列而设计的 PCＲ 引物， 可成 功鉴定出含酚废水中的苯酚降解菌。 实际生产中的含酚废水中不仅含有酚类物质， 通 常还含有许多重金属和高盐、 强碱或强酸性等不利影 响因素。因此， 利用基因技术构建高效降酚并对环境 无害的基因工程菌， 使其应用于含酚复杂的废水处理 系统中。同时， 利用基因工程技术将降酚基因和质粒 进行整合改造， 改变微生物细胞原有代谢途径以提高 其降解多种污染物的能力， 从而制造出降解各类芳香 族化合物的超级工程菌， 将成为科研和生产应用中的 主流发展方向。 目前国内在大批量制备固定化微生物的方式及 所需装置和固定化细胞反应器的研制等方面仍需加 强。此外， 现阶段的研究大多针对单一物质且应用规 模较小， 许多固定化技术的研究还处于试验阶段， 实 际运用中还存在成本过高等一些亟需解决的问题。 因包埋载体对降解底物 特别是氧气 和代谢产物具 有扩散阻力， 所以研究考察更多种固定化材料和固定 方法， 提供高效曝气， 混合设备以提供良好的微环境， 使其发挥固定化技术的高效作用。 参考文献 ［1］李绍峰，孙连鹏，黄君礼． UV/H2O2降解酚类物质动力学研 究［J］． 中山大学学报， 2004， 43 3 99- 102. ［2］水和废水监测分析方法编委会． 水和废水监测分析方法［M］． 4 版． 北京中国环境科学出版社， 2002. 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