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生物法去除西洋参中有机氯农药 ＊ 王丽坤 1 庞金钊 1 刘文芝 2 杨宗政 1 胡丽云 1 1.天津科技大学海洋科学与工程学院, 天津 300222; 2.北京市怀柔区科委药用植物研究所, 北京 101400 摘要 从西洋参种植土壤中分离到一株高效有机氯农药降解细菌 , 将该菌制成固体菌剂, 应用于田间试验, 实验结果 表明, 对 3 a 生西洋参的 1 a 生长期内 BHC 总量的降解率达 36. 27～ 49. 90, DDT 总量的降解率达 25. 19～ 35. 61。 关键词 有机氯农药 降解菌 西洋参 ＊天津市科委科技攻关项目 033104511 0 引言 有机氯农药主要包括 BHC 和 DDT 两种 , 属于高 残留 、 高毒害农药 ,对人体会构成极大的危害。有机 氯农药虽然在 80 年代已经禁止使用 ,但是在环境中 和生物体内仍然可以检出 ,而且环境中的含量远远低 于生物体内的含量, 这说明有机氯农药的生物富集作 用已经达到了很高的水平 ,并且有可能对生物体产生 危害 [ 1] 。 本研究从西洋参种植基地的土壤中分离一株杆 菌,利用它对有机氯农药进行降解实验并应用于西洋 参种植 ,能有效去除农药残留, 本方法用于农药降解 具有时间短,不产生二次污染等优点。 1 材料和方法 1. 1 菌源 西洋参种植基地的土壤中分离得到 。 1. 2 培养基 1 富集培养基 葡萄糖 2. 0 g L, 蛋白胨1. 0 g L, K2HPO40. 2 g L ,MgSO40. 1g L, pH 7. 0～ 7. 4,121℃灭 菌20 min 。 2 分离培 养基 NH4 2SO41. 0 g L , K2HPO4 0. 2 g L,MgSO40. 1 g L ,葡萄糖 0. 2 g L , pH 7. 0～ 7. 4, 121℃灭菌 20 min。 1. 3 方法 1. 3. 1 有机氯农药降解菌株的富集与筛选 将少量土样加入 100 mL 加有机氯农药富集培养 基中, 在 30 ℃ 恒温摇床上以 150 r min 进行振荡富集 培养72 h 后 ,吸取 10 mL 转接至新鲜培养基, 连续富 集,逐步加大有机氯农药浓度,转接 3 次后即得到对有 机氯农药耐受力强的降解菌富集培养液, 将富集培养 液在不同浓度有机氯农药含量的平板上划线分离,自 高浓度平板上长出的菌落 ,即可能为降解力强的菌株 。 1. 3. 2 菌株降解能力的测定 将初筛出的各菌株, 接种到加农药的培养基中, 30℃恒温摇床振荡培养 24 h, 再静置培养 20 d 同时 作不加菌的对照 ,离心取上清液,以丙酮和二氯甲烷 为萃取剂, 用气相色谱测定农残含量, 算出各个菌株 的降解率 , 得到一株降解能力较强的菌株 , 命名为 W1。 1. 3. 3 菌株生长曲线测定及菌剂制备 将一定菌液接种到培养液中,每隔 6 h ,测其光密 度 OD570 值 ,作菌株的生长曲线 ,将生长旺盛期的菌 液制成菌剂 。 1. 3. 4 田间试验方法 在西洋参种植基地, 设一对照一处理 ,小区面积 6 m 2 , 重复 3 次, 共 6 小区, 小区排列方式为随机排 列,每小区施菌剂 0. 4 kg ,12 个月后采根际土壤和西 洋参测定菌的降解能力 [ 2,3] 。 2 结果与分析 2. 1 菌种的筛选与鉴定 经平板涂布分离得到高效菌株 W1, 经 Biolog 自 动微生物分析系统的鉴定 ,该菌为荧光假单胞菌同型 小种 F Pseudomonasfluorescens biotype F 。 2. 2 菌株的生长繁殖特性 菌株生长繁殖特性可用菌株的生长曲线表示 图 1 。它是以 OD 值为纵坐标, 以培养时间为横坐 标作出的一条菌株生长曲线。从图 1 可以看出该菌 剂培养18～ 24 h 即是最佳应用期。 2. 3 影响降解效果的有关因素 1 温度 该菌在 20～ 35 ℃ 有较好的降解效果, 21 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 图 1 菌株 W1的生长曲线 在10 ℃ 以下无明显降解效果 。 2 pH 在 6～ 8范围内降解效果好,超出该范围 效果明显下降。 3 农药浓度 在低浓度时降解效果要好于高浓 度,当浓度 10 mg L 时该菌无法生长 。 2. 4 纯培养条件下菌株的降解效果 采用摇瓶接种培养 23 d 后 , 测定菌株对 BHC、 DDT 的降解能力,其测定结果见表 1。 表 1 纯培养条件下菌株 W1 降解 BHC、 DDT 的能力测定结果μ g kg 项 目α -BHCβ -BHCγ -BHCδ -BHC总量降解率 CK 不加菌株3 . 0995. 0863. 2214. 10415. 510 W11 . 7043. 8861. 9612. 3339. 88436. 27 op -DDTpp -DDTpp -DDEp p-DDD总量降解率 CK 不加菌株 20 . 60435. 8635. 2345. 62367. 324 W116 . 40021. 2583. 1033. 51446. 54531. 01 2. 5 菌剂在西洋参种植中的应用效果 1 菌剂在土壤中的降解效果见表 2。 表 2 菌株 W1 在土壤中的降解效果μ g kg 项 目α -BHCβ-BHCγ -BHCδ -BHC总量降解率 对照 10 . 4782. 7820 . 0343. 4166. 710 处理 10 . 0381. 2650 . 0292. 6714. 00340 . 34 对照 20 . 6582. 7320 . 5313. 1047. 025 处理 20 . 4911. 6200 . 2221. 9224. 25539 . 43 对照 30 . 0351. 4090 . 1813. 2534. 878 处理 30 . 0020. 3760 . 0302. 0362. 44449 . 90 项 目op -DDTpp -DDTpp -DDEp p-DDD总量降解率 对照 18 . 93919. 8098 . 1185. 10350. 908 处理 18 . 62716. 1996 . 0083. 99134. 82531 . 59 对照 212 . 44122. 41413 . 3827. 20055. 437 处理 210 . 19315. 8369 . 6065. 33840. 97326 . 09 对照 38 . 88216. 67314 . 6245. 47645. 655 处理 36 . 07111. 57910 . 1473. 00229. 39935 . 61 该土壤取自西洋参根际, 因为根际环境作为一个 在植物生长 、 吸收和分泌以及土壤、水 、 大气 、 微生物 等综合作用下形成的具有独特物理 、 化学和生物学性 质的微型生态系统 ,对于污染的产生、迁移转化和归 宿有着重要的影响 [ 4] 。 2 菌剂在西洋参中的降解效果见表 3。 表 3 菌株 W1在西洋参中的降解效果μ g kg 项 目α -BHCβ-BHCγ -BHCδ -BHC总量降解率 对照 11. 7855. 3691 . 7454. 77515. 459 处理 10. 5474. 6601 . 4802. 7959. 48238 . 66 对照 21. 3313. 4591 . 2293. 5089. 527 处理 20. 8222. 2100 . 8031. 9045. 72939 . 87 对照 31. 9324. 5960 . 4573. 86810. 853 处理 31. 0533. 0470 . 1002. 5736. 77337 . 59 项 目op -DDTpp -DDTpp -DDEp p-DDD总量降解率 对照 116. 05125. 4539 . 3828. 55259. 439 处理 19. 48418. 9466 . 4436. 86241. 73529 . 08 对照 213. 25723. 36715 . 8988. 41660. 938 处理 29. 69316. 07412 . 7617. 06245. 5925 . 19 对照 312. 89324. 25816 . 0239. 19662. 37 处理 38. 46016. 96411 . 2287. 85144. 48528 . 68 由表 2、 3 可以看出西洋参中有机氯农药含量基 本高于土壤中, 因为有机氯农药为脂溶性 ,西洋参又 含有相当数量的挥发油, 且为多年生根类 ,易受有机 氯农药污染 。 由表 1、 2、 3 可以看出 该菌剂对 BHC 和 DDT 的 同分异构体均有一定程度的降解,该菌剂可通过生化 反应使六六六和滴滴涕转化为毒性较小的物质,如五 氯环乙烯和滴滴伊, 进一步转化为无毒的小分子物 质,如二氧化碳和水 [ 5] 。且该菌剂经过毒理学实验证 明安全无毒 。而西洋参有效成分的测定实验也表明 对西洋参的品质没有副面影响 。 3 结论 菌株W1 对 BHC 和 DDT 均有一定程度的降解, 在纯培养条件下 , 对 BHC 总量的降解率达 36. 27, 对DDT 总量的降解率达 31. 01。该菌制成菌剂应 用于田间试验, 也取得了类似的降解效应 ,在土壤中, 对BHC 总量的降解率达 39. 43～ 49. 90 , 对 DDT 总量的降解率达 26. 09～ 35. 61; 在西洋参中, 对 BHC 总量的降解率达 37. 59～ 39. 87, 对 DDT 总 量的降解率达 25. 19～ 29. 08 。 下转第 12 页 22 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 3 结论 实验中利用特异性引物针对 AOB 菌群进行分 析。电泳中共分离到 AOB 类 的 16SrDNA 片段约 13 条,水力停留时间与曝气强度的改变对于菌群结 构具有不同程度的影响 。不同工艺参数对于菌群影 响程度存在差别 ,利用 MDS 方法评估不同样品间的 相似性程度 ,结果表明 , 水力停留时间能够造成菌群 更大的改变 。作为硝化过程中的主要功能菌群,AOB 类在系统运行过程中基本保持了稳定, 主要的优势细 菌种类没有太大变化 。此外, 实验中进水氨氮浓度在 一定程度上存在波动 ,水力停留时间的调整同时也意 味着处理负荷的变化 ,说明系统在不同的负荷冲击下 具有很好的适应性。 利用 PCR-DGGE 方法可以避免传统培养过程所 受到的微生物培养性的限制, 一方面可利用多样性指 数、 聚类分析、 MDS 分析等方法分析特定微生物群落 的结构特征,另一方面也可通过分离过程取得的特定 微生物核酸片段 ,进行目标菌种的分类学鉴定 ,获得 系统微生物组成信息 。目前在环境科学领域 ,该项技 术已经得到了一定的应用 。这项技术的更好运用也 有赖于特定微生物群落知识的积累与特异性引物的 设计 。 参考文献 [ 1] 夏四清, 徐斌, 高廷耀, 刘新超. 悬浮填料床生物预处理黄浦江 原水中试研究. 同济大学学报, 2003, 31 8 977 -981. 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[ 5] 夏北成. 环境污染物生物降解. 北京 化学工业出版社, 2002 320 -323. 作者通讯处 王丽坤 300222 天津市河西区大沽南路 1038 号 天 津科技大学海洋科学与工程学院 168信箱 E -mail wlkun24sohu. com 2005- 07-15 收稿 12 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 ISOLATION AND NUTRIENT BALANCE OF PREDOMINANT BACTERIA FOR DEGRADING PETROLEUM OF CONTAMINATED SOILHuang Tinglin Chai Beibei Ning Yaping7 Abstract In order to restore the soil contaminated by petroleum more effectively, a strain of highly efficient petroleum degrading bacteria, which hasbeen differentiated as Zoogloea sp. ,was enriched and isolatedfrom the contaminated soil by using the oil as the only source of carbon. Whose nutrient balance conditions were studied initially. The experimental results indicated that ammonium nitrate NH4NO3was the predominant nitrogen source and the nutrient balance between N and P ratio for this strain kept at N∶ P4∶ 1. Keywords soil lightly contaminated by oil, predominant bacteria to degrade oil, screening isolating and nutrient balance STABILITY ANALYSIS OF AOB COMMUNITY IN NITRIFYING SUSPENSION FILLER TOWER Wang Feng Xia Siqing Shi Yan et al 10 Abstract It was studied that ammonia -oxidizing bacteria AOBcommunity in a nitrifying suspension tower for biochemical flocculation process, using PCR -DGGE technique. The change in systematic AOB community structure was examined under the regulation of aeration strength and hydraulic residence time RHT. The biofilm sampleswere takendirectly from a nitrifying filler tower. MDS was used for the analysisof DGGE electrophoretogram, and the results were displayed by 2 -D pattern. The results show that the aeration strength and RHT have a certaineffect on AOB community. The main AOB strains remain unchanged in the process of running. Keywords polyase chain reaction, concentration gradient of gel electrophoresis and AOB THE FUNCTION OF PROTOZOA SARCODINA AS NITRIFICATION INDICATOR IN THE PROCESS OF SEQUENCING BATCH REACTORDing Guoji Li Jun 13 Abstract The analysis of relationship between the density of Sarcodina and the nitrification ratio in the process of sequencing batch reactor SBR under the control of aeration showed that Arcella gibbosa, Arcella vulgaris and Pyxidicula operculata were good nitrification indicator. However, A. gibbosa and A. vulgaris were better than P. operculata as the nitrification indicator considering the relativity with nitrification ratio and the convenience of observation. Keywords SBR process, Sarcodina, nitrification and indicator PRIMARY STUDY ON PHYTOREMEDY OF CONTAMINATED WATERWITH PCOPs Wan Dajuan Chen Xian Jia Xiaoshan 16 Abstract Phytoremediation of contaminated water with PCOPs 1, 2, 4-TCB and pp ′ -DDTwere studied by the of water -culture medium. Results showed that ryegrass could absorb and degrade 1, 2, 4 -TCB and pp′ -DDT, reduce the content of PCOPs in water. The growth of ryegrass was affected by the variety and concentration of PCOPs. The absorption capability of ryegrass inwater was lower than in soil. Keywords plant, absorb, degrade, water and PCOPs EFFECTS OF PLANT SELECTIONON THE NITROBACTERIA DENSITY IN RHIZOSPHERE AND NITROGEN REMOVAL IN CONSTRUCTED WETLANDS Zhou Wei Huang Minsheng Nian Yuegang 18 Abstract Effects of plant selection on the nitrobacteria density in rhizosphere and nitrogen removal in constructed wetlands had been presented. Experimental results showed that there were very high density of nitrobacteria in the rhizospheres of wetlands planted with Zizania caduciflora, Scirpus validus, Iris pseudacorus under appropriate DO and pH conditions. Nitrobacteria density in the rhizosphere is always higher than that in the substrate of the wetlands which is due to the difference of DO levels. And the nitrogen removal efficiencies are related positively to the nitrobacteria density and water temperature, which indicates nitration of microbes and assimilation of the plants played important roles in the nitrogen removal of wetlands. Keywords constructed wetlands, rhizosphere, ntrobacteria, nitrogen removal and experimentation DEGRADATIONOFORGANOCHLORINEPESTICIDESINAMERICANGINSENGBY BIOLOGICAL WAYWang Likun Pang Jinzhao Liu Wenzhi et al 21 Abstract The bacterial strain which can degrade organochlorine pesticideswith high effect was isolatedfrom soil planted American ginseng. The solid preparation made by the strain applies to field experiments via three -year -old ginseng in one year, indicating the degradation rate of the strain for total amount of BHC up to 36. 27～ 49. 90, the degradation rate of the strain for total amount of DDT up to 25. 19～ 35. 61. Keywords organochlorine pesticides, degrading bacterium and American ginseng EXPERIMENT ON THE COUPLING BIOREACTOR FOR THE DOMESTIC WASTEWATER TREATMENT OF LOW C N RATIO IN DIFFERENT OPERATING MODES Li Jun Zhang Ning Yang Haiyan et al 23 2 ENVIRONMENTAL ENGINEERING Vol. 24,No. 3, Jun. , 2006