白腐真菌对石油污染土壤的修复研究.pdf

化学工程师 C h e mi c a l E n g i n e e r 2 0 1 5年第 0 4期 油i { 葺 l 他 尝 DO I 1 0 ． 1 6 2 4 7 ／ j ． e n k i ． 2 3 - 1 1 7 1 A q ． 2 0 1 5 0 4 4 1 白腐真菌对石油污染土壤 的修复研 究 谭丽泉 ， 余梅 ， 周天 ， 彭镇 宇 广东石油化工学院 化学工程学院 。 广东 茂名 5 2 5 0 0 0 摘要 以原油为反应底物 ， 利用白腐真菌作为降解菌 ， 考察了土壤含水率、 摇床转速、 土壤含油率 、 T w e e n 8 0及藜芦醇等因子对土壤中原油降解率的影响，筛选出含水率、含油率、 T w e e n 8 0为响应面的实验因 素， 对石油降解条件进行优化。结果表明 在选取的 3 个因素的水平范围内， 对石油降解率的影响大小依次 为 含油率含水率T w e e n 8 0 ， 含水率和含油率的交互作用对土壤中石油的降解率影响较显著。响应面模型 优化后得到的最佳降解条件为土壤含水率 5 8 ． 2 ％、 土壤含油率 8 ． 2 7 ％、 T w e e n 8 0 2 ． 9 3 C M C， 此时土壤中石油的 预期降解率能达到 6 0 ． 9 3 ％； 验证实验得到的降解率为 5 8 ． 6 8 ％， 达到理论预测值的 9 7 ． 7 3 ％。 关键词 白腐真菌； 石油污染； 降解； 土壤 中图分类号 Q 9 3 9 ． 1 1 文献标识码 A S t u d y o n r e m e d i a t i o n o f p e t r o l e u m c o n t a m i n a t e d s o i l b y wh i t e - r o t f u n g i T AN L i q u a n， YU Me i ， Z HOU T i a n ， P ENG Z h e n - y u C o l l e d g e o f C h e mi c a l E n g i n e e r i n g ， G u a n g d o n g U n i v e r s i t y o f P e t r o c h e mi c al T e c h n o l o g y， Ma o mi n g 5 2 5 0 0 0 ， C h i n a Ab s t r a c t Cr u d e o i l w a s c h o s e a s r e s p o n s e s u b s t a n c e i n o r d e r t o s t u d y t h e f a c t o r s i n fl u e n c e o i l d e g r a d a t i o n r a t e b y w h i t e r o t f u n g i t ．T h e f a c t o r s i n c l u d i n g t h e mo i s t u r e c o n t e n t o f s o i l ， t h e o i l c o n t e n t o f s o i l ， t h e r o t a t i o n s p e e d， t h e c o n c e n t r a t i o n o f T w e e n 8 0 a n d t h e e o n c e n t r a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o 1 ． T h e mo i s t u r e c o n t e n t ， o i l c o n t e n t ， T w e e n 8 0 i n r e s p o ns e t o t h e t e s t we r e fil t e r e d o ut a s t h e f a c t o r s b y r e s p o ns e s u r f ac e me t h o d． Th e e x pe r i me n t us e d De s i g n Ex p e r t t o d o t h e r e s p o n s e s u r f a c e o p t i mi z a t i o n e x p e ri me n t ． T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t wi t h i n t h e s c o p e o f t h e l e v e l s o f t h r e e f a c t or s 。t h e i mpa c t o n t he o i l de g r a d a t i o n r a t e a s f o l l o ws o i l c o nt e nt moi s t u r e c on t e nt T we e n8 0 ，mo i s t ur e c o n t e n t a n d o i l c o n t e n t of i n t e r a c t i o n h a s o b v i o u s i mp a c t o n o i l d e gra d a t i o n r a t e i n t h e s o i l ． T h e n t h r o u g h t h e r e s p o n s e s u rf a c e me t h o d ， t h e o p t i mi z e d c o n d i t i o n s o b t a i n e d w e r e mo i s t u r e c o n t e n t 5 7 ％ ， o i l c o n t e n t 8 ． 4 2 ％ a n d T we e n 8 0 3 ． 8 6 CMC． t h e d e gra d a t i o n r a t e of p e t r o l e u m c a n r e a c h t o 6 0 ． 9 3 ％ ．Th e c o n fi r ma t o r y e x p e rime n t h a s f 0 u n d o u t t h a t t h e a c t u a l d e gra d a t i o n r a t e o f p e t r o l e u m i s 5 8 ． 6 8 ％ ． wh i c h h a s r e a c h e d 9 7 ． 7 3 ％ o f t h e p r e d i c t e d v a l u e ． Ke y wo r d s w h i t e - r o t f u n g i ； p e t r o l e u m p o l l u t i o n ； d e gra d a t i o n； s o i l 随着石油企业 的飞速发展 ， 石油类污染物对土 壤 的污染逐渐 成为各个 国家环境污染 的一个重 大 的问题 ， 大量石油污染物进入 土壤 ， 不但破坏 土壤 的质地和养分构成 ， 而且还使其丧失可耕性与生物 活性f 1 1 ， 加上土壤的 自净能力有限 ， 一旦受到破坏要 让其 自然恢 复就变得极为艰难。因此 ， 采取有效措 施， 治理土壤石油污染显得尤为迫切。 生物修复技术是 土壤污染治理技术发展 过程 收稿 日期 2 0 1 4 1 1 - 1 2 基金 项 目 广东省科技计 划项 目 2 0 1 0 B 0 3 1 8 0 0 0 1 0 作者简介 谭丽泉 1 9 7 8 一 ， 女， 广东茂名人 ， 硕士， 讲师， 主要从事环 境微生物修复研究工作。 通讯作者 周天 1 9 6 4 一 ， 男 ， 生物学教授 。 中的一个里程碑【 “】 。作为生物修复技术中的一员， 用于污染物降解的白腐真菌， 不仅具有广谱、 高效、 低耗、 适用性强等特点， 而且对营养要求低、 耐受性 高 ， 还能对其它微生物产生较强的拮抗作用 ， 有着 其它生物系统 ，特别是细菌系统所不具备的优点 ， 受到世界各国科学界及工业界的高度重视【 。前人 利用其对染料废水及多环芳烃等进行 了处理 ， 取得 较好的效果 们 。 本研究以白腐真菌作为降解菌， 通 过室内模拟实验利用响应面优化设计对白腐真菌 降解石油的条件进行研究， 以期找出白腐真菌降解 土壤 中石油的有利条件 ， 为土壤石油污染微生物修 复技术的应用提供依据。 4 2 谭 丽泉 等 白腐真 菌对石油污染土壤 的修 复研 究 2 0 1 5年第 o 4 期 1实验材料 1 ． 1 主要试 剂及 仪器 实验所用石油取 自茂名石化公司炼油厂， 为黑 色黏稠液体， 1 6 0 C下恒温蒸馏 4 h 后置于棕色试剂 瓶中备用； N a H 2 P O 、 硫胺素、 石油醚 6 0 ～ 9 0 ℃ 、 正己 烷 、 丙酮、 藜芦醇 、 T w e e n 一8 0 、 苯甲醇和 Mg S O 7 H 2 0 等试剂均为分析纯， 天津大茂化学试剂厂。 Y X QL S一3 0 S 1 1型立式 压力 蒸汽 灭菌 器 、 T H Z一9 2 B型气浴恒温振荡器 上海博迅实业有 限 公 司医疗设备厂 ； L R H一1 5 0 B型培养箱 广东省 医 疗器械厂 ； 8 0 0 型离心机 上海精密科学仪器有限 公司 ； T U 一 1 8 1 0紫外可见分光光度计 北京普析通 用仪器有限责任公司 ； R E 一 5 2 C S 旋转蒸发仪 上海 亚荣生化仪器厂 。 1 ． 2 菌种 实验所用 白腐真菌 黄孢原毛平革菌 5 ． 7 7 6 购 自广州微生物菌种保藏 中心。 1 ．3 培养基及菌悬液 P D A固体养基 马铃 2 0 0 g ， 葡萄糖 2 0 g L ～ ， K H 2 P O 4 3 g L - 1 , Mg S O a “ 7 H 2 O 1 ． 5 g L - 1 硫胺素 8 mg 。 ， 琼脂 2 0 g L - I 麦麸 1 5 g ， p H值为 6 ， 蒸馏水 1 L 。 供降解用的菌悬液配制 将经扩大培养并产生 孢 子的菌种从 4 ℃冷冻保存 的冰箱 中转人 2 8 ℃培 养箱中解冻复苏后， 于超净工作台上用无菌水倒入 平板中轻轻摇荡， 使充分分散后转入灭菌的三角烧 瓶中， 制成乳白色的孢子悬浮液， 4 保存⋯]。 1 ．4 污染土壤的制备 实验土壤取 自广东石油化 工学 院校无石 油污 染 的土壤 ， 用锄头挖取土层 1 0 c m以下的土壤 ， 风干 后用 4 0目筛子过筛 ，把大块的石头和其它杂质去 除后放于阴凉处备用【 】 。根据一定土壤含油率往 已 称重烧杯中加入适量土壤及石油， 加人石油醚使其 充分混合均匀后将石油醚挥发至恒重， 算出土壤实 际含油率。 2 实验方法与分析方法 2 ． 1 实验方法【 B l 2 ． 1 ． 1 单 因素实验以土壤含水率 、摇床转速 、 土 壤含油率 、 T w e e n 8 0及藜芦醇为影 响因子进行单 因 素研究 ， 将降解体系在 5 个锥形瓶中称取含油率为 8 ． 0 ％的土壤 6 g ， 灭菌后加入 2 mL菌悬液 ， 加入适量 的无菌水 ， 在 2 8 ℃、 1 2 0 r m i n 条件下恒温培养 9 d ， 考察各 因素对土壤 中石油降解 的影响 ， 每组做两个 平行实验。 2 ． 1 ． 2 响应面法优化降解条件根据单因素实验 结果 ，采用 3因素 3水平 响应 面 B o x B e h n k e n设 计， 优化土壤中石油降解条件， 实验因素及水平编 码如表 1 。 表 1 因素及水平编码表 T a b ． 1 T e s t f a c t o r s c o d i n g t a b l e 注 各因素编码值 ， 各 因素真实值 。 2 ． 1 _ 3 验证实验根据软件 D e s i g n e x p e r t 7 ． 0分析 得 出的最佳水平组合进行验证实验 ， 平行三次实验 得出平均值。 2 ． 2 分析 方法 2 ． 2 ． 1 白腐真菌生物量的测定 采用细胞干重法 】 。 2 ． 2 ． 2 石油降解率 的测定 降解后 的污泥体系高压 灭菌后 ， 用 2 0 0 mL 1 1 的正己烷 ／ 丙酮混合液索 氏抽提 4 8 h后旋转蒸发至剩余 5 m L液体 ， 转移到 已 称重锥形瓶， 将锥形瓶置于水浴锅中以 5 0 ℃把溶剂 蒸干至恒重 ， 锥形瓶增加 的重量 即为土壤中石油的 重量 。每组做一个无菌体系的空白实验 ， 以消除石 油挥发所带来的误差。 2 ． 2 ． 3 石油降解率的计算 石油的降解率 ％ 1 0 0 ％ b 1 式中G 。 无菌体系石油含量； G 有菌体系剩余石油 含量。 3 结果与讨论 3 ． 1 单因素实验结果 3 ． 1 ． 1 含水率对白腐真菌降解土壤中石油的影响 5 个锥形瓶 中称取含油率为 8 ． O ％的土壤 6 g ， 灭菌后 加入 2 mL菌悬液 ， 加入适量的无菌水调节其含水率 分另 0 为 4 0 ％、 5 0 ％、 6 0 ％、 7 O ％、 8 O ％， 2 8 ℃、 1 2 0 r m i n 条件下恒温培养 9 d后测其石油降解率。实验结果 见图 1 。 2 0 1 5年第 0 4期 谭丽泉等 白腐 真菌对石 油污染土壤 的修 复研 究 ’ 4 3 4 5 4 0 5 琏 世 3 O 蠼 2 5 2 0 4 0 5 O 6 O 7 O 8 O 90 含水率 ／ ％ 图 1 含水率对土壤 中石油降解的影响 Fi g． 1 Ef f e c t o f mo i s t ur e c o n t e n t o f pe t r o l e u m i n t he s o i l d e g r a d a t i o n 由图 1 可知， 不同含水率对白腐真菌降解石油 有很大的影响。石油降解率先随着土壤含水率的增 加逐渐升高， 含水率为 4 0 ％时降解率只有 3 2 ．4 ％； 含 水率为 5 0 ％时降解率达到 3 5 ．3 ％，而当含水率为 6 0 ％时达到最大降解率 4 0 ．7 ％， 之后降解率随着土壤 含水率的增加而下降。 实验结果表明， 土壤含水率在 4 0 ％～ 6 0 ％ 的范围内对石油的降解效果较好。土 壤含水量对土壤中石油的微生物降解有很大的影 响【 l 5 1 ， 因为水会在土壤颗粒表面形成一层水膜 ， 对 石油与土壤颗粒 问的联系 、 吸附产生 了阻碍 ， 并形 成了油水界面 ； 而土壤 中的微生物大多存在于油水 界面 ， 因此土壤含水量增多会增加微生物与石油 的 接触 ， 促进石油的降解 ； 而土壤含水过低使微生物 生长得不到充足的水分 ， 细胞活性受到抑制 ， 降解 能力下降 。但是土壤含水率过高又会造成土壤淹渍 的现象 ， 使土壤 中的氧气含 量减少 ， 而 白腐真菌用 于降解有 机物 的木质素过氧化 物酶和锰过氧化物 酶必须首先与有氧条件下合成的 H 2 0 反应才能实 现有机物的降解 ， 因此， 对石油的降解产生影响。根 据实验结果 ， 选用土壤含水率为 6 0 ％进行后续实验 。 3 ． 1 ． 2 摇床转速对 白腐真菌降解土壤 中石油的影 响准确称取含油率为 8 ． O ％的土壤 6 g 至锥形瓶， 灭菌后加入 2 m L菌悬液 ， 并加入适量 的无菌水调节 其 含 水 率 为 6 0 ％，考 察 转 速 0 、 4 0 、 8 0 、 1 2 0 、 1 6 0 、 2 0 0 r m i n 对石油降解的影响， 实验结果见图 2 。 0 40 8 0 1 2 O 1 6 0 2 0 0 2 4 0 摇 床转 速 ／ r mi n 图 2 摇 床转 速对 白腐真菌 降解 土壤 中石油 的影响 F i g ． 2 E ff e c t o f r o t a t i o n s p e e d o f p e t r o l e u m i n t h e s o i l d e g r a da t i o n 由图 2 可知， 白腐真菌降解石油的能力先是随 着 摇床 转速 的上 升 而逐渐 升 高 ， 在 转 速 为 1 6 0 r ra i n 时达到最大石油降解率 3 6 ．6 8 ％，之后转速增 大降解率降低。 这是由于振荡培养条件下加速了营 养物和氧气在细胞间的传质效率； 同时振荡速度越 快 ， 剪切力越强 ， 形成的 白腐真菌菌丝小球体积越 小 ， 增大了菌丝小球的表面积， 和氧气充分接触 ， 并 获取更 多的营养物 ， 促进 了菌 的生长及产酶 ， 有利 于石油的降解。而过高的转速则会使菌体受到强的 剪切力冲击而死亡【 l 1 。 3 ． 1 ． 3 土壤含油率对白腐真菌降解土壤中石油的 影响准确称取含油率分别为 1 ．6％、 3 ．2 ％、 8 ．0 ％、 1 2 ． 8 ％、 2 0 ． 0 ％的土壤 6 g至 5个锥形瓶 ， 灭菌后加入 2 m L菌悬液 ，调节体系含水率为 6 0 ％， 1 2 0 r mi n ～ 、 2 8 ℃下恒温培养 9 d 后测其石油降解率 ，实验结果 见图 3 。 5 5 5 0 堡4 5 料 眭 4 O 世 辱 3 5 3 O 2 5 O 3 6 9 1 2 1 5 l 8 21 土壤含油率 图 3 土壤含油率对 白腐真菌降解土壤中石油的影响 F i g ． 3 E f f e c t o f t h e o i l c o n t e n t o f p e t r o l e u m i n t h e s o i l d e g r a d a t i o n 由图 3 可知， 石油降解率随土壤石油含量的增 大而增高 ， 当石油含量达到 8 ．0 ％时降解率达到最大 值 4 8 ． 5 3 ％，之后随着土壤石油含量的增多而下降 ， 当土壤 中的石油含量达到 2 0 ． 0 ％ 时降解率只有 2 9 ． 9 2 ％。石油浓度较低 时可以作为碳源被 白腐真菌利 用， 促进菌的生长， 从而有利于石油的降解； 而石油 浓度过高会导致 土壤 中产生难分散的厚油层 ， 使土 壤 中营养物和氧气缺乏 ， 菌的活性及降解 能力都受 到影 响【 1 8 ] 。 3 ． 1 ．4 T w e e n 8 0 对白腐真菌降解土壤中石油的影响 因为土壤对石 油有吸附性 ， 会影 响微生物对土壤 中石油的降解。石油的增溶洗脱是微生物修复石油 污染土壤 的前提 ， 因此选用 了非离子型表面活性剂 T w e e n 8 0 做研究。 往降解体系中加入T w e e n 8 0 ， 使其 柏 褂齄逝景 谭丽泉等 白腐真菌对石油污染土壤 的修 复研 究 2 0 1 5年第 0 4期 在 体 系 中 的 浓 度 分 别 为 2 C MC 、 3 C MC 、 4 C MC、 5 C MC 、 6 C M C T w e e n 8 0的临界胶束浓度 C M C值为 1 4 mg L J ，加人 2 mL菌悬液后置于摇床中恒温培 养后测其石油降解率 ， 实验结果见图 4 。 2 3 4 5 6 7 T we e n8 0 ／ C MC 图 4 T w e e n 8 0对 自腐真菌 降解土壤 中石油的影响 F i g ． 4 E f f e c t o f T we e n 8 0 o f p e t r o l e u m i n t h e s o i l d e g r a d a t i o n 由图 4可知 ， T w e e n 8 0在较低浓度时 T w e e n 8 0 ，含水率和含油率的交互作 用对土壤中石油的降解率影响较显著。响应面模型 优化后得到 的最佳降解条件 为土壤含水率 5 8 ． 2 ％、 土壤含油率 8 ． 2 7 ％、 T w e e n 8 0 2 ． 9 3 C MC，此时土壤 中 石油的预期降解率能达到 6 0 ．9 3 ％； 验证实验得到的 降解率为 5 8 ． 6 8 ％， 达到理论预测值的 9 7 ． 7 3 ％。 参考文献 [ 1 ] 杜显元． 石油开采区土壤污染物源解析、 毒性及快速检测法研 究[ D] ． 北京 华北 电力大学 ， 2 0 1 2 ． [ 2 ] 田苗． 石油降解菌的筛选及对石油污染土壤的修复实验[ D ] ． 陕西 西北大学 ， 2 0 1 0 ． 【 3 J S anj e e t Mi s s h r a ， J e e v an J y o t ． I n s i t u b i o r e m e n d i a t i o n p o t e n t i al of a l l o i l y alu d g e - d e g r a d i n g b a c t e ri al c o n s o r t i u m [ J ] ．C u r r e n t Mi c r o b i o l o g Y ， 2 0 0 1 ， 4 3 5 3 2 9 - 3 3 5 ． 【 4 j H UB A L E K T ， VO S A HL OV A S， MA T E J U V， e t o 1 ． E c o t o x i c i t y m o n i t o r i n g o f s o i l d u rin g b i o r e me dia t i o n a c a s e s t u d y [ J ] ． A r c hE n c ir o nC o n t a inT o x i c o l ， 2 0 0 7 ， 5 2 1 1 - 7 l 5 j DI P L O CK E E， MARD L I N D P ， K I L L H AM K S ， e t o 1 ．P r e d i c t i n g b i o r e me d i a t i o n ofh y d r o c arb o n s l a b o r a t o r y t o fi e l d s c ale【 J J ．E n v i r o n P o l l u t ， 2 0 0 9 ， 1 5 7 6 1 8 3 1 1 8 4 0 ． [ 6 ] 王聪颖 ， 王芳 ， 王涛 ， 等． 生物强化和生物刺激对土壤中 P A H s 降解的影响[ J ] ． 中国环境科学， 2 0 1 0 ， 3 0 1 1 2 1 1 2 7 ． [ 7 ] 李慧蓉． 白腐真菌的研究进展[ J ] ． 环境科学进展， 1 9 9 6 ， 4 6 6 9 7 7． [ 8 ] 常天俊， 潘文维 ， 赵丽， 等． 白腐真菌对染料脱色的培养条件研 究 [ J ] ． 环境工程学报， 2 0 0 7 2 5 4 5 8 ． [ 9 ] K o s c h o r r e c k K， R i c h t e r S M， S w i e r e z e k A， e t o 1 ． C o mp ara t iv e c h a r a c t e fiz a t i o n o f f o u r l a c c a s e s f r o m Tr a me t e s v e r s i c o l o r c o n c e rn i n g p h e n o l i c C C c o u p l i n g a n d o x i d a t i o n o f P A Hs [ J j ． A r c h i v e s o f B i o c h e mi s t r ya n d B i o p h y s i c s ， 2 0 0 8 ， 4 7 4 1 2 1 3 2 1 9 ． [ 1 0 ] 边名鸿， 叶光斌，杨跃寰- 白腐菌处理染料废水的研究进展[ J ] ． 四川理工学院学报 自然科学版 ， 2 0 1 3 ， 2 6 4 1 4 ． [ 1 1 ] 陈建海， 李慧蓉． 黄孢原毛平革菌对多环芳烃菲的生物降解 [ J ] ． 江苏石油化工学院学报， 2 0 0 0 ， 1 2 3 2 5 2 8 ． [ 1 2 ] 张红．黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶酶活的提高及其在 石油降解中的应用研究[ D ] ． 乌鲁木齐 新疆农业大学， 2 0 0 6 ． [ 1 3 ] 任红梅， 刘左军， 袁慧君， 等． 低温纤维素降解菌的筛选及其产 酶研究 [ J ] ． 食 品工业科技 ， 2 0 1 3 ， 5 ． [ 1 4 ] 李晔， 陈新才， 王焰新． 石油污染土壤生物修复的最佳生态条 件研究[ J ] ． 环境科学与技术， 2 0 0 4 ， 2 7 4 1 7 1 9 ． [ 1 5 ] 顾传辉， 陈桂珠． 石油污染土壤生物降解生态条件研究[ J ] _ 生 态科学， 2 0 0 0 ， 1 9 4 6 7 7 2 ． [ 1 6 ] 高大文， 文湘华， 钱易． 白腐真菌培养条件对其分泌木质素降解 酶的影响[ J ] ． 中国环境科学 ， 2 0 0 5 ， 2 5 5 5 7 2 5 7 5 ． [ 1 7 ] 杨国君． 两株假单胞菌摄取与降解烷烃研究[ D ] ． 无锡 江南大 学， 2 0 0 4 ． [ 1 8 ] 陈静， 王学军， 胡俊栋， 等． 表面活性剂对白腐真菌降解多环芳 烃的影响[ J ] ． 环境科学， 2 0 0 6 ， 7 2 1 1 5 41 5 9 ． [ 1 9 ] 张丽芳， 肖红， 魏德洲． 表面活性剂对土壤石油污染物微生物 降解的影响[ J ] ． 辽宁化工， 2 0 0 2 ， 3 1 1 2 5 0 95 1 3 [ 2 0 ] 谭丽泉， 余梅， 黄敏， 等． 黄孢原毛平革菌的生长及降解石油条 件的优化[ J ] ． 化工环保， 2 0 1 2 ， 2 1 1 1 - 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