一株石油烃降解菌的筛选及性能评价.pdf

第 2 6卷 第 6期 大庆石油地质与开发P ． G ． O ． D ． D ． 2 0 0 7年 1 2月 1 1 9 文章编号 1 0 0 0 3 7 5 4 2 0 0 7 0 6 - 0 1 1 9 - 0 5 一 株 石油烃 降解茵 的筛选及 性能评价 周金葵 ，王大威 ，廖 明清 ，刘永建 1 ．大庆职业技术学院 ，黑 龙江 大庆1 6 3 7 1 2；2 ．大庆石油学 院，黑龙江 大庆1 6 3 3 1 8 3 ．大庆油 田有限责任公 司 测试技术服务分公司 ，黑龙江 大庆 1 6 3 4 1 2 摘要从 大庆油 田分离到一株可降解石油烃的微生物菌株 ，经鉴定为洋葱伯克霍 尔德 氏菌 B u r k h o l d e fi a c e p a c i a 。菌株经过了室内生化特性、产生活性物质乳化原油的能力等详细的评价。结果显示， 原油在该茵种作用后轻质组分增加 ，原油的族组成发生了变化 ，粘度下降，改善 了原油流动性质。岩 心物理模型驱油实验证明，微生物驱比水驱提 高采收率 8 ． 2 ％左右 ，并具有较好的重复性。 关键词微生物采油；洋葱伯克霍尔德 氏菌；石油烃降解 中图分类号 T E 3 5 7 文献标 识码 A S c r e e ni n g a n d pe r f o r ma nc e e v a l u a t i o n o f o ne pe t r o l e u m h y dr o c a r bo n de g r a d i ng ba c t e r i u m Z H O U J i n k u i ，WA N G D a w e i ，L I A O Mi n g q i n g ，L I U Y o n g j i a n 1 ． D a q i n g P r o f e s s i o n S c h o o l ， D a q i n g 1 6 3 7 1 2， C h i n a ；2 ． D a q i n g P e t r o l e u m I n s t i t u t e ，D a q i n g 1 6 3 3 1 8 ，C h i n a ； 3 ． W e l l L o g g i n g T e c h n o l o g y S e r v i c e C o m p a n y o fD a q i n g O i lfi e l d C o m p a n y L t d ． ，D a q i n g 1 6 3 4 1 2 ，C h i n a Abs t r a c t On e b a c t e r i u m ，Bur k h o l d e r i a c e p a c i a，wh i c h c a n d e g r a de c r ud e o i l ，h a s s c r e e n e d f r o m Da q i n g o i l f i e l d．Th e b i o c h e mi c a l p r o p e r t i e s a nd c a p a bi l i t y t o c r e a t e a c t i v e ma t e r i a l f o r o i l e mul s i fic a t i o n h a v e b e e n e v a l u a t e d i n l a b ． T he r e s uh s s u g g e s t t h a t a f t e r t i l e e f f e c t o f t hi s k i n d o f b a c t e r i u m ，t he c o mp o n e n t s o f o i l h a v e c h a n g e d wi t h t h e i n c r e a s e o f l i g ht c o mp o n e n t ，d e c r e a s e o f v i s c o s i t y a n d i mp r o v e me n t o f o i l flo w p r o p e rti e s ．Ac c o r d i ng t o c o r e s i mu l a t i o n，t h e r e c o v e r y r a t i o o f MEOR c a n b e 8． 2％ ， h i g h e r t h a n t h a t o f wa t e r f l o o d i n g．a n d MEOR c a n be u s e d for mu l t i t i me s ． Ke y wo r ds MEOR；Bu r kh o l d e r i a c e p a c i a；d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n 微生物采油是技术含量较高的一种提高采收率技 术 ，不但包括微生物在油层 中的生长、繁殖和代谢等 生物化学过 程，而且包 括微生物菌体 、微生物 营养 液 、微生物代谢产物在油层 中的运移 ，以及与岩石 、 油、气 、水相互作用导致复杂的提高采收率机理和驱 油机理 引。 微生物降解石油烃是微生物采油的机理之一 ，由 美国微生物学家 Z o b e l l 首先提出。该理论认为 ，自然 界有许多微生物能够以烃类作为生长的唯一碳源和能 源 ，而且其利用石油烃 的能力主要依赖于烃类混合物 中各化合物的性质 。目前的大量研究也证 明微生物可 以将长链烷烃降解成碳链较短的烷烃 ，改变石油的组 成 ，实现石油化学品的生物转化 ，获得优质汽油等。 此外 ，微生物降解烃类在环境保护方面也有重要的意 义。本文研究了一株微生物菌种对大庆原油的降解作 基金项目 收稿 日期 作者简介 用，为微生物采油机理研究奠定 了基础。 1 材料和方法 1 ． 1 培养基 1 富 集 培 养 液 g ／ L 液 体 石 蜡 2 0 g ； K 2 HP O 4 1 0 g ；N a H 2 P O 4 5 g ； N H 4 2 S 0 4 2 g ；Y e a s t 1 g； Mg S O4。7H2 O 2 00 mg； Ca C1 22H2 O 1 mg； Fe S O 4 7 H O 1 m g ；调 p H值在 7 ． 0～7 ． 2之间。 2 平板培养基 g ／ L 蛋 白胨 1 0 g 、牛 肉膏3 g 、N a C 1 5 g 、琼脂 1 8 g 、蒸馏水 或 自来水 1 L 、 用酸或碱调 p H值为 7 ． 0 。 3 复筛摇瓶培养基 大庆油田采油一厂产出污 水 ， 氯化钠 ， 磷酸氢二钠 ， 磷酸二氢钾 ， 硫酸镁 ， 氯化氨 ， 酵母浸粉及微量元素 ， p H值在 7 ． 0～ 7 ． 2之间 ， 4 5 。 国家级重大基础研究前期研 究专项 2 0 0 5 C C A 0 6 2 0 0 和黑龙江省 自然科学基金项 目 E 2 0 0 5 2 3 联合资助。 2 0 0 7 l l 9 周金葵 1 9 5 6一 ，男，吉林松原人 ，副教授 ，从 事钻井 工程 和微生物采油技 术研究 。 维普资讯 1 2 0 大庆石油地质与开发P ． G ． O ． D ． D ． 第 2 6卷 第6期 1 ． 2 B UC D菌株的理化分析及系统分类鉴定 1 菌株形态特征 、生理生化实验及 菌种类 型 鉴定方法见文献『 4 ] 。 2 摇瓶油降解分析 将液体样 品全部倒人 5 0 0 mI 分液漏斗 中，加入 5 mL H， S O 及 2 0 g N a C 1 ，加 塞摇匀 ，然后用 2 0 mL正 己烷 冲洗样 品，再 重复用 1 0 m L正 己烷冲洗样品，收集提取液 ．用正 己烷补足 至 3 0 m L ，然后取 1 m L注入 2 5 m 【 容量瓶里 ，加正 己烷至标线 ，待测绘制标准 曲线。摇瓶油降解测定 用 7 5 5 0分光光度计在波长 2 5 6 n n l 处，1 c m石英 比 色杯以正己烷为参比测定吸光度 ，并在标准曲线上查 出相应的浓度值，计算原油降解率。 3 菌体浊度分析吸取 4 m L液体样品于安 瓶 中，放人浊度计中，记录浊度 。 1 ． 3 微生物实验菌性能评价 1 B U C D ． 2菌株对原油的降解实验 在模拟油藏温度 的条件下，即 4 5 ℃观察 B U C D ． 2 菌株降解分散原油的效果。在降解实验中，原油的加 入量通常在 3 ％ ～1 0 ％之 问，主要检测实验菌种是否 具有降解分散原油的能力 。 2 降解后原油族组成 、饱 和烃分析 、含蜡含 胶量变化的测定方法见文献 [ 5 ] 。 3 B U C D 菌株对原油流变性的影响 将微生 物作 用 前 后 的 油样 经离 心 脱 水 后，用 H A A K E R S 1 5 0流变仪测定 在剪切 速率范 围 0 ． 0 1～ 1 0 0 0 S 之间，温度为 4 5℃条件下的剪切应力和表 观粘度的变化。 4 B U C D一 2菌株对原油粘温曲线的影响 原油特别是含蜡原油的流变特性随温度的变化极 为显著，因而常用特征温度来评价原油的流动状态 ， 以确保原油管输工艺的经济性和运营的安全性 。测定 含蜡 原 油 的析蜡 点常 采用 剪 切应 力一温度 曲线 法 即粘度增加法 ，测定异常点采用平衡粘温曲线法 。 5 物理模拟实验 通过物模实验研究微生物对油藏环境的适应性及 其驱油效果 ，并为现场试验方案提供理论参数。采用 人造岩心柱进行室内物理模拟驱油实验 ，原油为大庆 第三采油厂联合站原油 ，粘度为 1 9 ． 9 m P a S 。注入 方式 模 型通 过 水 饱 和 、油 饱 和 、水 驱 油 到 含水 98 ％ 。 选用 B U C D 菌株 ，模拟大庆油田低渗透油藏条 件 ，采用水驱 、微生物驱对 比的方法 ，进行微生物提 高采收率实验 岩心模型在抽空饱和水 ，测定孔隙体 积后 ，用油驱水的方法饱和油，建立好原始含油饱和 度 ，然后进行两组驱替实验。 第一组 继续注入 1 P V地层水 ，封闭岩心两端 于 4 8 ℃下培养，1 2周后再进行水驱。 第二组 注入含有营养物的地层水 ，注入量为 1 P V，封闭岩心两端于 4 8℃下培养 ，1周后再进行水 驱 。 第三组 注 入含有 营养物和 B U C D一 2菌 的地层 水 ，注入量为 1 P V，封闭岩心两端于 4 8 ℃下培养 ，1 周后再进行水驱 。 2 结果与分析 2 ． 1 B UC D- 2菌株鉴定结果 2 ． 1 ． 1 形 态特征 B U C D 一 2菌株细胞短杆状 ，单个或成对排列，长 度 1 ． 5～2 ． 0 m，直径 0 ． 4 m，无芽孢 ，有荚膜 ， 不运动 ，菌落 网形 ，直径 2～3 mm。表 面湿润 ，光 滑 ，厚 ，边缘整 齐 ，高 突起，正反 面黄色 ，不 透明 图 1 。 图1 B U C D - 2 菌株的反射电子显微照片 9 5 o o Fi g ．1 T he re fl ec ti o n el ec t ron mi cr o gr ap h o f b a c t e r i a B U C D - 2 9 5 0 0 2 ． 1 ． 2生理 生化 特征 经过实验测试 ，B U C D ． 2菌株的生理生化特征最 适生长温度 3 5℃，且 4 5℃能生长 ，但 4℃不生长。 过氧化氢酶 、氧化酶及硝酸盐还原实验 阳性 。MR、 V P、吲哚 、石蕊牛奶 、精氨酸双水解酶 、明胶液化， 淀粉水解等实验阴性 。能利用葡萄糖 、甘露糖 、海藻 糖 、半乳糖 、纤维二糖 、山梨糖 、L 一 精氨酸为唯一碳 源生长，但不 能利用肌醇 、菊糖 、L 一 鼠李糖 、麦芽 糖。能利用 乙酸盐 、柠檬酸盐 、琥珀酸盐 、D L 一 酒石 酸盐 ，但不利用草酸盐 、苯 甲酸盐 、D 一 酒石酸盐。根 据上述结 果 ，将 B U C D 菌株 初步鉴定 为假单胞菌 P s e u d o m o n a s 。 2 ． 1 ． 3 菌种类型初步鉴定 利用法国生物梅里埃公司的细菌鉴定仪测定了筛 选部分的细菌 的生化反应。选用 I D 3 2 G N鉴定试 剂 维普资讯 2 0 0 7年 l 2月 周金葵等 一株石油烃降解菌的筛选及性能评价 ‘ 1 2 1 条 ，3 0℃培养 2 4 h ，经鉴定进一步确定 B U C D 一 2菌 株为洋葱伯克霍尔德氏菌 B u r k h o l d e r i a c e p a c i a 。 2 ． 1 ． 4 洋葱伯克霍 尔德 氏菌体 生长及石 油降解率变 化 在培养过程 中，1 d后 水相 开始 出现 明显 的混 浊 ，表明菌体 已经开始生长。4 d时菌体浊度达到较 高水平，并一直维持到第 7 d ，随后菌体浓度下降。 实验菌株在2 d 后开始表现出一定的降解能力，随着 培养时间的延长，降解率增加，7 d时达到较高水 平 ，基本稳定在 2 0 ％左右 图 2 。 1 2 3 4 5 6 7 8 时 间／ d 图2 B UC D一 2 菌体生长及石油降解率变化 F i g ． 2 T he gr o wt h o f b a c te ri a B U C D 一 2 a n d c ha ng e s o f o i l d e g r a d at i o n r a t e 菌体在培养液中浓度增加 ，表明该菌可 以利用原 油作为营养基质进行生长。根据文献报道 ，不同的石 油降解菌对于石油中各种不 同的烃类具有不同的降解 能力，多数菌一般只能降解一种或几种烃类。所以营 养基质的消耗可能是限制菌体持续增长并达到较高浓 度的原因之一 。另外 ，石油’ 中的某些组分对于大多数 石油降解菌来讲具有一定的毒性 ，如短链 的烷烃 、萘 等。石油降解菌对某些烃类 的代谢过程中，往往会产 生一些有生物毒性 的产物。这些有毒物质 的积累可能 是导致实验后期菌体浓度下降的原因之一营养组分 的 减少 ，溶解氧 的降低 ，有毒物质 的积累 ，菌体浓度 的 大幅度下降 ，是影响石油降解率持续增长 的几个主要 原 因 。 2 ． 2微生物实验菌性能评价 2 ． 2 ． 1 B U C D ． 2菌株对原油的降解实验 由于微生物 以原油为碳源生长，改变 了原油的性 质，使原油的组分发生了改变。图 3是摇床发酵后的 三角瓶 ，可以看到 ，与对照相 比，发酵液的颜色明显 加深 ，而且 ，作用后的原油具有不挂壁的特点。 菌株作用后的原油在显微镜下观察 图4 ，发 现原油中有菌液存在 ，细菌存在油水界面上 ，并以油 为碳源 ，适应环境并产生驱油物质 ，从 而起 到乳化 、 润湿、分散原油的作用。 2 ． 2 ． 2原油 族组 成分 析 由于原油的胶质 、沥青质主要 由非烃类物质组成 A 作用后 B作用前 图3微生物作用原油前、后照片 Fi g． 3 Ph ot os o f oi 1 b e for e an d af te r t h e d eg ra dat i on of b ac te ri a 图4微生物作用原油倒置电子显微照片 Fi g ．4 T he i nve rt ed el e ct ro n mie ro gr ap h of oi l a ft er b act e ria d eg ra dat i on 9 0 ％以上 J ，在分析 和数据处 理时 ，将 胶质 、沥 青质与非烃一起考虑 ，这样既不影响对 比结果 ，还有 利于考查微生物作用前后原油族组成的变化规律 。微 生物作用后 ，原油中饱和烃 、芳烃以及非烃的相对含 量都有不 同程度的变化 表 1 ，这是 由于微生物选 择性降解 原油 中不 同组 分的结果 J 。尽管不 同微生 物对相同原油中各类组分的作用有所差异 ，但都表现 出微生物作用后原油中饱和烃相对比例增加 ，非烃和 沥青质相对 比例减少 ，但菌株 B U C D ． 2作用原 油后 ， 芳烃组分增加 ，分析原 因认 为洋葱伯 克霍尔德 氏菌 B u r k h o l d e r i a c e p a c i a 对苯 环有 降解 作用 ，将 多苯 环芳烃降解为苯环少的芳烃 。 表 1 菌株 B U C D- 2对原油作用后族 组成变化 Ta bl e 1 Gr ou p c ompo s i t i o n c han ge s af t e r t he e f f e c t of b ac t e r i t i m BUCD 一2 族组成／ ％ 和 撵 芳 烃魏 搬魏 青 霍 叠 ／ ％ ／ ％ ／ ％ 质 ／ ％ BUCD一 2 6 4 ． 5 5 2 ． 7 9 2 0 ． 6 8 8 ． 21 1 3 ． 0 31 4 ． 2 8 1 ． 7 53 9 ． 2 4 空 白 6 2 ． 8 0 1 9 ． 1 1 1 5 ． 2 0 2 ． 8 8 越艇 粗 6 5 4 3 2 l O 如 m 5 O ＼ 瓣琏 趣隧 维普资讯 1 2 2 大庆石油地质与开发P G ． O ． D ． D ． 第 2 6卷第 6期 2 ． 2 ． 3原 油 中饱 和 烃分析 为了进一步了解微生物在大庆油层条件下降解原 油的规律 ，将分离得到的饱和烃进 行 了气相色谱分 析。 表 2是菌种 B U C D 一 2对大庆原油作用前后气相色 谱全烃分析结果。结果表 明大庆原油经菌种 B U C D ． 2 作用以后，碳链分布发生了明显的变化 ，高碳链烃的 相对含量降低 ，低碳链烃的相对含量则相应增加，∑ n C 一 ／ ∑n C 由原来 的 l 。 3 1分别升高到 1 ． 6 6 ，增 加了 2 6 ． 7 2 ％ ；说明所筛选的菌种优先降解 高碳饱和 烃，从而可改善原油的流变性，有利于提高原油的采 收率 。老鲛烷 P r 2 ，6 ，1 0，1 4 一 四甲基 五烷 和植烷 P h 2 ，6 ，1 0 ，1 4 一 四甲基十六烷是原油 中的生物标志化合物 ，结构 比较稳定 ，微生物作刖一 般不影响它在原油 中的含量 从分析 结果可 以看 出，菌种 B U C D 2作用大庆原油后 ，都程度不同地引 起 P r ／ n C ， 与 P h ／ n C 值的变化。B U C D 一 2作用后，P r ／ n c 2 7 与P h ／ n C 2 8 值分别增加 3 1 ． 8 ％和 2 7 ． 8 ％； C 2 I C 2 2 ／ C C 值 增 加 了 l 5 ． 8 ％，说 明 菌 种 B U C D ． 2对原油中高碳链 的饱和烷烃都具有生物降解 作用[ 9 - 1 6 ] 。 表 2 微 生物作 用前 、后原油 中饱和烃 气相色谱分析结果 Ta b l e 2 GC NM RS a n a l y s i s o f s a t u r a t e d h y d r o c a r b o n a mon g o i l s a mpl e s be f or e a nd a f t e r 从分析结果还可以看出，P r ／ n C 。 与 P h ／ n C 。 在微 生物作用前后几乎没有变化 ，说明菌种 B U C D 一 2对原 油中低碳链饱和烷烃几乎没有生物降解作用 ，同时还 预示出微生物在降解原油中高碳链饱和烷烃时没有低 碳链饱和烷烃的生成。 2 ． 2 ． 4菌株 B U C D 一 2对原油含蜡含胶量变化的影响 筛选菌种经降粘实验评价 ，对大庆油样 的含蜡含 胶量具有较好的作用效果 ，特别是原油粘度大于 8 0 mP a S ，含蜡大于 2 0 ％ ，含胶高于 3 0 ％ 的油样作用 效果突出，其中含蜡 率降低达到 2 1 ． 5 ％，含胶率降 低达到 3 0 ． 7 ％ ，而且平行实验结果的重复稳定性较 好 表 3 。 2 ． 2 ． 5 筛选菌种对原油流变性的影响 从 图5可以看到 ，在菌株 B U C D 一 2作用后原油的 流变性发生 了变化，在剪切速率范闭 0 ． 0 1～1 0 0 0 s 内表观粘度均有不同程度的降低 。由于原油巾含有高 分子烃以及胶质的含量越多则粘度越高。由此 ，该菌 株能够降低原油粘度的一个可能原 因是 菌株能够降 解原油中某些相对分子质量较大的烃和胶质，使大分 子烃和胶质的量减少，从而降低原油的粘度。其次， 菌株对大分子烃的降解使原油中小分子烃的量有所增 加 ，小分子烃 相 当于轻质油在体系 中起 到稀释 剂的作用 ，因而导致原油粘度的降低。在高粘度原油 中，高分子烃的含量相对较多，所以细菌对它的降粘 作用就较明显。 表3 菌株 B U C D． 2作用原油前、后 含蜡含胶量的变化 Ta b l e 3 Th e c h a n g s o f wa x c o n t e n t a n d g e l c o n t e n t b e f o r e a n d a f t e r t h e d e g r a d a t i o n o f b a c t e r i u m BUCD 一2 7 皇 ＼ 鼷 图5菌 株B U C D 一 2 处理 前、 后原 油表现 牯度和剪 切速率的 关系 Fi g． 5 R e l a t i o ns h i p b e t we e n t h e a p p a r e n t v i s c o s i t y a n d s h e a r r a te be f o re an d a f t e r t h e d e g ra d a t i o n o f b a c t e ri 岫叫 C 2 2 ． 2 ． 6 筛选菌种 对原 油粘 温曲线 的影响 网 6表示在不同温度下微生物处理后油样的表观 皇 ＼ 摇 露 温嫂 ／ ℃ 图6菌株B UC D - 2 处理前 、后原油粘温 曲线的变化 Fi g 6 C h a n g e o f vi s c os i t y t e m pe r a t u r e C U l v e b e f o r e a n d a f t e r t h e de g r a d at i o n o f ba ct e ri u m B U CD - 2 维普资讯 2 0 0 7年 1 2月 周金葵等一株石油烃降解茵的筛选及性能评价 l 2 3 粘度值与处理前下降幅度变化十分 明显 ，特别是初始 的表观粘度值大幅降低，这表明微生物的降解作用不 仅改变原油的组分和结构 ，而且其生成的各种代谢产 物产生的乳化降粘效果更有助于石油 的开采和输送 。 2 ． 2 ． 7物理 模拟 实验 结 果 当岩心经过培养后 ，再进行三次水驱 ，仍然使用 地层水 ，一直驱到含水 9 8 ％，计算各岩 心产出的总 油量 ，并计算出终采 收率 ，与一次水驱采收率 比较 ， 可以得到提高采收率值 ，结果见表 4 。 表 4 微生物驱油物模实验结 果 Tab l e 4 Phy s i c a l s i mul at i o n e xp er i me nt r e s u l t s o f MEOR 岩心驱油实验结果表明 ，第一组在一次水驱采收 率 4 1 ． 8 ％以后 ，在高温下培养一周后 ，再进行水驱 ， 其采收率提高 1 ． 5 ％ ，分析认 为，这是由于在培养过 程中，岩心中的残余油重新分布，这样在二次水驱时 仍可驱出部分残余 油，因此 ，有一定的采 收率提高。 第二组中加入 了部分营养 ，可被地层水 中 内源菌利 用 ，但这部分 内源菌生长并没有 明显提高采收率 ，所 以二次水驱时只能提高采收率 1 ． 8 ％，和水驱相近， 因此也就摈弃 了内源菌株对采收率的影响。第三组 中 加入了 B U C D 一 2菌，这样岩心中的内源菌，又有加入 的 B U C D - 2 外源菌 ，同时还有 营养 的存在 ，但最 终提高采收率达 8 ． 2 ％ ，明显高于第 一组和第二组 ， 说明其 中起作用 的只有外源的 B U C D 一 2菌株。 3 几点认识 微生物对石油烃的降解主要取决于微生物菌种的 降解能力和烃化合物的化学结构 。石油烃是 自然产生 的有机化合物 ，自然界中已演化出能利用这些化合物 作为能源 和碳源 的微生物是理所 当然的。本实验 就 B U C D 一 2菌株对大庆原油的降解研究表明 ，该菌种对 原油中高碳链的饱和烷烃都具有生物降解作用 ，同时 对原油中低碳链饱和烷烃几乎没有生物降解作用。物 理模拟实验进一步证明在模拟油层条件下，所筛选的 菌种以原油为唯一碳源生长 、繁殖 良好 ；在水驱采油 之后微生物驱可以提高采收率达 8 ． 2 ％左右。 参考文献 [ 1 ]R e b e c c c a S B ． Wo r l d w i d e a p p l i c a t i o n s o f mi c r o b i a l t e c h n o l o g y f o r i m p r o v i n g o i l r e c o v e r y[ R]． S P E 3 5 3 5 6 ，1 9 9 6 ． [ 2 ]L a z a r I ． I n t e r n a t i o n a l ME O R a p p l i c a t i o n f o r ma r g i n a l w e l l s[ J ]． P a k i ． s i a n J o u ma l o f Hy o h o c a r b o n R e s e a r c h ，1 9 9 8 ，2 0 4 1 1 - 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