石油污染土壤中细菌群落结构特征.pdf

2 0 1 0年 1 2月 石油学报 石油加工 A C T A P E T R O L E I S I N I C A P E T R O L E U M P R O C E S S I N G S E C T I O N 第 2 6卷第 6 期 文 章 编 号 1 0 0 1 8 7 1 9 2 0 1 0 0 6 0 9 2 8 0 6 石 油污 染土壤 中细菌群落结构特征 万春黎 ，杨 雪，杜茂安 ，于春光，李观元 哈尔滨工业 大学 市政环境 程学院，黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 9 0 摘要采用聚合酶链式反应 P C R 技术 变性梯度凝胶电泳 D G G E 技术 ，解析 r石油污染土壤 中细菌 群落结构特 征。 果表明 ，l住总f 油烃的质量分数高 于 3 0 rag ／ g 以干土汁 的重度污染 区域 ，井距相 同的土样 中的细菌群落表 现出对石油污染胁迫较为一致 的响 ，某些乳球 菌 L a c t o c o c c u s s p ． 和尢色 细菌 A c h r o mo b a c t e r s p ． 等细菌相对 数 量显著增加 ，可以判 断其对石油烃的降解起着重要作用 。通过对细菌群落结构 的解析 ，可以为石油污染土壤 的微生 物修复提供理论依据 。 关键词 石油烃 ；土壤 污染 ；P C R D G GE；细菌群溶 中 图分 类 号 X1 7 2 ；TE9 9 1 文 献 标 识码 A d o i 1 0 ． 3 9 6 9 ／ j ． i s s n ． 1 0 0 1 - 8 7 1 9 ． 2 0 1 0 ． 0 6 ． 0 1 6 CHARACTERl S TI CS oF BACTERI AL COM M UNI TY I N LoNG TERM oI L PoLLUTED S oI L W A N Ch un l i ，YANG Xu e，DU M a o a n，YU Chun gu a n g，LI Gu a n yu a n Sc ho o l o f Mu n i c i p a l a n d En v i r o n me n t al En gi n e e r i n g，Ha r b i n I n s t i t u t e o f Te c h n o l o g y，Ha r b i n 1 5 0 09 0，C hi n a Ab s t r a c t PCR DGGE wa s us e d t o i nv e s t i g a t e t he s t r u c t ur e O f b a c t e r i a l c o mm u ni t y i n o i l c on t a m i n a t e d s o i l ． Th e r e s ul t s s ho we d t h a t t h e ba c t e r i a l c o m mu ni t y r e s p o nd e d r e ma r ka bl y t o t h e e n v i r o n me n t a l s t r e s s i n t h e h e a v y p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n s p o l l u t e d a r e a wi t h a c o n t e n t o f 3 0 mg ／ g ba s e d o n t he ma s s o f d r y s o i l ．And t he r e l a t i v e q u a nt i t y o f s o m e me mbe r s of g e n e r a La c t o c o c c u s s p ． a nd 以c 矗r 0 “ 2 D 6 以 c ￡ r s p ． r e ma r k a bl y i nc r e a s e d， whi c h m i gh t pl a y a n i mpo r t a nt r ol e i n t he o i l d e g r a d a t i o n ． The a n a l y s i s o f ba c t e r i a l c o mmun i t y s t r u c t u r e wo ul d pr o v i d e c r u c i a l f ou nd a t i o n i n t h e t h e o r y f or mi c r o b i a l r e me d i a t i o n o f po l l ut e d s o i l s ． Ke y wo r ds pe t r ol e um hy dr o c a r bo n s；po l l ut e d s o i l ；PCR DGGE；b a c t e r i a 1 c o m mu ni t y 土壤 的石 油 污染 是 随 着石 油 的大 规 模 开采 、加 工 和运输等 过程 出现 的环境 污 染 问题 。土 壤 受 到石 油 污染 后 ，会 直 接 影 响大 气 、地 下水 、河 流及 农 作 物 的安 全性 。为此 ，针 对 石 油污 染 的有 效 修复 已经 引起 了人们 的高度 重 视 ，而 开发 安 全高 效 的修 复 技 术仍是 当前亟待解决的问题_ 1 ] 。微生物修复技术 由 于具有 处理费 用 低 、无二 次 污染 、可原 位处 理 等 优 点 ，具 有广 阔 的应 用 前 景 。 _ 。‘ ] ，许 多学 者 在 这 方 面 已经 进 行 了 大 量 的研 究 并 取 得 了 较好 的 效 果[ 4 ] 。 该技术 的核 心问题 在 于功 能微 生 物 的筛选 和 目标种 群在 原位环境 中的 动态 消 长 ，因此 ，实 时解 析 石油 污染／ 修 复过程 中微生 物 的群落 结构特征 具有重 要 的 理论 和现实意义 。 近 年来 ，随着 分子 生 物学 技术 的发 展 ，用 于 原 位解析微 生物群 落 结构 的分 子生 态学 技 术 ，如末 端 限制性 片 段 长度 多态 性 T R F L P 分 析 技 术 、单 链 构象 多态 性 S S C P 技 术_ 7 、变 性 梯 度 凝 胶 电泳 D G GE 技术 等得到广 泛应 用 。其 中 DG GE技 术 收 稿 日期 2 0 0 9】 2 1 2 基金项 目国家重大基础研究发展计划“ 8 6 3 ” 项 目 2 0 0 7 AA0 6 1 2 0 0 和黑龙江省教育厅科学技术研究项 目 1 1 5 4 4 0 3 8 资助 通讯联系人万春黎，Te l 0 4 5 1 8 1 7 7 O 1 7 6 ；E ma i l h i t wa n l 6 3 ． C O F I1 第 6 期 石油污染土壤中细菌群落结构特征 9 2 9 由于具备 操作 简 单 、检 测 效率 及 准 确 率 高 、重 现性 强 等优点 ，成 为微 生 物种 群 分 析 应用 最 为 广 泛 的 分 子 生态学 技术 。其 原 理 是通 过 设 置 变 性剂 梯 度 ，将 长 度 相 同 但 序 列 不 同 的 双链 DNA 片 段 区 分 开 _ 9 一 。 在 石油 污 染 土 壤 的 微 生 物 群 落 研 究 过 程 中 ，王 君 等[ 1 以 D GG E 图谱 为指 导 ，结 合 多 元 细 菌 培 养 技 术 ，从 高温 油 藏 中获 得 了 3株 高 温 石 油 烃 降解 菌 ； R a mi r e z等一 ” 采用 类似 策 略也 可达 到 优化 筛选 石 油 降解菌的 目的；贾建丽等l_ l 。 ] 应用 DG GE技术对 中 国不 同区域 环境下 的油 田区石 油 污 染 土壤 中微 生 物 多态性进 行评 价 ，揭 示 了环 境 胁 迫 下 微生 物多 态 性 与石油 降解 活性 之 间 的依 赖关 系 ，为 提高 石 油 污 染 的降解 和菌株 的筛 选提 供 了客观参 考 。 笔者 采用 聚合 酶链 式 反应一 变 性梯 度凝 胶 电泳技 术 P C R D G GE ，探讨 了受 不 同程度 石 油 污 染 土壤 中细菌群 落 的结 构 特 征 ，定 性 分 析石 油 污 染 过程 引 起的细菌群落演替规律 ，为生物修复技术 的开发提 供 有力 的理论依 据 。 1材 料 与 方 法 1 ． 1土壤 样 品采集 土壤样 品采 自大 庆 油 田某 采 油 区 5个 采油 井 附 近 ，石 油 污染均 在 1 a以上 。将 采 集 获 得 的土 壤 样 品置 于冰上 ，立 即带 回实验 室 ，将 相 同井距 采样 点 与采油 井 的距 离 的样 品分别 取 1 g混匀 ，直 接进 行 D NA 的提取 。取样位 置及 对应 编号 如表 1所示 。土 样 A、B 、C、E、F为受 石 油污染 程度 不 同的土 壤 ， 其 中总石油烃 质量 分数 为 1 8 ． 1 ～7 8 ． 6 mg ／ g 以干 土 计 ，下 同 。土样 D 为 未 受 石 油 污 染 ，作 为 空 白对 照样 品 ，其 总石油烃 质量 分数 在 0 ． 1 mg ／ g以下 。 表 1 土 样 采 集 位 置 Ta bl e 1 S oi l s a m p l i ng po s i t i o n 1 ． 2基 因组 DN A 提 取 ” ] 取 5 g土 样 进 行 基 因 组 提 取 。最 终 将 D NA 沉 淀溶 解在 6 O L TE缓 冲液 2 mmo l ／ L Tr i s 中。将 该粗 提液 置于 1 琼 脂 糖 凝胶 中 ，在 1 0 0 V 电压 下 电泳 5 0 mi n ，将 基 因组 片 段切 取 下 来 ，采 用上 海 华 舜胶 回收试 剂 盒进 行 纯 化 回 收 ，最 终 获 得 3 O L 纯 化 的基 因组 D NA。 1 ． 3 P C R 扩 增 采 用 细 菌1 6 8 r R NA 基 因V3 区 通 用 引 物 3 3 8 F 5 一 ACTCCTACGGGAGGCAGCAG一 3 ， 5 3 4 R5 一 ATTACCGC GGCTGCTGG一 3 ，反 向 引 物 5 3 4 R的 5 端带有 GC夹。采用 5 0 I 扩增体系 进 行 P C R 扩 增 。扩 增 体 系 组 成 1 OP C R B u f f e r Mg Pl u s 5 ff L，d NTP Mi x t u r e 各 2 ．5 mmo 1 4 ff L，引 物3 3 8 F 2 0 ff M 1 ff L， 引 物5 3 4 R 2 0 ff mo 1 1 ff L，模 板 D NA 2 ． 5 n g ，Ta q D NA 聚合 酶 大 连 宝 生 物 0 ． 1 5 U，去 离 子 水 补 至 5 O I 。 P C R 扩增 程序 9 4 ℃ 预 变 性 1 0 mi n ；接 以 3 0个 循 环 ，即 9 4 ℃变性 1 mi n ，5 5 ℃ 退 火 1 rai n 每个 循 环 降低 0 ． 1 ℃ ，7 2 o C延 伸 1 ． 5 rai n 。循 环 完 毕 ，7 2 ℃ 延伸 1 0 mi n 。P C R完 成 后 ，取 5 ff L 跑琼 脂 糖 凝 胶 电泳 ，检测 产 物 的纯 度 和浓度 。 1 ． 4 DGGE分 析 条件 采 用 B i o R a d公 司 D c o d e 基 因突 变 检测 系统 对 P C R 产 物进 行分 离 。首先 制备 8 的聚丙 烯 酰胺 凝 胶 ，变 性 剂 浓 度 从 4 0 到 6 O 梯 度 变 化 浓 度 1 0 0 的变 性 剂 为 7 mo l ／ L 的尿 素 和 4 O 的去离 子 甲酰 胺 的 混 合 物 。上 样 后 ，于 6 0 ℃ 、 电压 1 5 O V 电泳 7 ． 5 h ，然 后 进 行 银 染 。染 色 后 的凝 胶 用 透 射 扫 描 仪 获 取 图 谱 ，并 利 用 P HYL I P 4 ． 0 、 S P S S 1 2 ． 0 等软 件进 行分 析 。 1 ． 5 条 带切 取及 克隆 测序 分析 切取 图谱 上 的 目的 条 带 ，溶 解 于 2 0 L 1 T E 2 mmo l ／ L T r i s 中 。以 此 为模 板 ，采 用 相 同的 引 物重 新进 行 P C R 扩 增 ，并 对 扩 增 产 物进 行 切 胶 回 收 。 回收后 的 产 物 连 接 到 p MD 1 8载 体 大 连 宝 生 物 ，转入 E．c o l i DH5 a ，通 过 氨 苄 抗 性 和 蓝 白斑 筛选获得阳性克隆 ，采用 AB I 3 7 3 0测序仪测序。将 测 得 的序列 与 Ge n b a n k中 的 已有 序 列 进 行 B l a s t比 对 ，对 土壤 样 品 中的 1 6 S r RNA 基 因序 列 进 行 分类 及 系统 发育 分 析 ] 。 2结 果 与讨 论 2 ． 1基 因组提 取及 P CR 扩增 结果 基 因组 DN A 的质量关 系 到 D GG E 分 析 的准确 9 3 O 石 油 学 报 石 油 加 工 第 2 6卷 性 ，利用试 剂盒将 提 取 获 得 的 D NA 粗 提 液 纯化 来 降低 或去除腐 殖 酸 、离 子 等杂 质 ，以避 免 这 些杂 质 对后续 P C R扩增 过程所 带来 的抑制 。 图 1 为 提取 的 土壤基 因组 D GG E 图谱 ，图 2为 提取 的土壤基 因组 P C R 扩增 DG GE 图谱 。 图 1 从石油污染土壤提取 的基因组 D GG E谱 Fi g ．1 DGGE m a p o f g e no me e xt r a c t e d f r o m o i l c o nt a m i n a t e d s o i l } B { { E p r e s e nt f or s i x s a mp l e s i n Ta b l e 1 ，r e s p e c t i v e ly M1 is g e n o mi c c o n t r o l Ma r k e r X Hi d Ⅲ 图 2 从 石 油 污 染 土壤 提 取 的 基 因 组 P C R DGGE 谱 Fi g ． 2 DGGE p r o f i l e s o f PCR a m pl i f i c a t i on o f g e n o m e e xt r a c t e d f r o m o i l c o nt a m i na t e d s o i l C} D} E| p r e s e n t f o r s i x s a mp l e s i n Ta b l e 1，r e s p e c t i v e l y M i s PCR p r o d u c t c o n t r o l M a r k e r DL2 0 0 0 由图 1可 以看 出 ，提 取 的土 壤基 因组 DN A 为 l 条 清 晰 条 带 ，无 降 解 ，无R NA 污 染 ， 大 小 在 2 3 k b 以上 。 采用 细菌通用 引物 3 3 8 F和 5 3 4 R 进 行 P C R 扩 增 ，扩增 的 目的片段是 1 6 S r R NA 基 因上 的 V3区 ， 是 1 6 S r R NA 基 因的 高变 区 ，在细 菌 的繁 殖 进化 过 程 中碱基序 列及 结构 变 化较 大 ，已经被 公 认 可 以作 为 分离鉴定 大多数 真 细 菌 的特 征 区域 。 由图 2可 以 清 晰看到 ，P C R 产物 片段 的大小 略低 于 2 5 0 b p ，符 合 目的片段 大小 。 2 ． 2 D G G E指纹 图谱分 析 试验 中 6个 土 样 的 P C R D GG E 如 图 3所 示 。 由于 P C R D G GE技术 仅能分 辨 占种群 数量在 1 0 o 以 上 的类 群 ，而土 壤 中虽 然 微 生 物 的 多 样 性 较 高 ， 但是单 一微生 物种 群 的数 量相 对 较低 ，因此 未受 石 油污染 的土样 D 中 ，能检 测到 的微生 物种 群条带 较 少。当石油进入土壤后，引起了土壤中微生物种群 的变化 。石油 烃类 污 染物 可 以作 为 细菌 的碳 源 ，随 着时 间的延 长 ，许 多 细 菌开 始逐 渐 降解 石 油烃 ，并 进行 繁殖 ，成为 该 区域 土 壤 中的 优势 菌 。但 是 ，细 菌对 于石油烃类 底 物存 在 耐受 阈值 ，不 同细 菌 的耐 受 阈值不 同，这 就导 致 了在 不 同石 油 污染 程度 的土 壤 中，其微生物的群落结构特征存在差异 。 微 生物群 落结构 特 征差 异 的大 小 可 以用 主成分 分析进行 比较 ，如 图 4 所 示 。土样 E和 F 中细菌群 落结构 相似性较 高 ，达 到 9 6 ． 6 ，聚 为一类 ；而 土 样 A 和 B 的相 似性 可 达 9 8 ． 5 ，聚 为一 类 。结合 实际土壤样品的特点 ，E与 F、A 与 B都是受石油 污染程度 较为严 重 的 区域 ，总 石油 烃 的质 量分 数 均 高于 3 0 mg ／ g ，石油污染胁迫下土壤 中细菌群落的 响应较为 一致 ，因此相似性 较高 ；土样 D 的采 样点 较 远 ，其 总石油烃 质量分数 低于 0 ． 1 mg ／ g ，作 为空 白对照土壤 ，轻微 的 石油 污染 对 其 中微 生 物种 群 的 胁 迫性及选 择 性较 低 ， 因此 ，与其 他土 样 中微 生物 的相似性 较低 ，即使 与受 污染较 轻的土 样 C 中的微 生 物种群 相似性也 只有 8 6 ． 3 。 豢蒸 瑟 一 江 鏊 ；二 簧 第 6期 石油 污染土壤 中细 菌群落结构特征 9 3 1 s ． D／ ／ I | ● 1 0 0 5 0 0 ． 5 1 0 1 5 Comp on e n t l 图 4 DGGE 图 谱 的 主 成 分 分 析 Fi g ． 4 Pr i n c i p a l c o mpo ne nt s a na l y s i s o f DGGE pr of i l e s 2 ． 3条 带的克 隆测序 及 分析 从表 观上 分 析 P C R D GG E 图谱 条 带 的亮 度 和 数量仅可提供样 品中微生物群落结 构的宏观信息 ， 还需 要将 图谱上 的条 带切 取下来 进行 克隆 测序 分析 ， 进一 步确定 图谱 中的 条带 所 指 示 的微 生物 种 属 。这 种定 性分 析可 以更好 地 认 识 样 品 中 的微 生 物种 群 组 成及其 演 替过程 。将 图 3中较 为典 型的条 带 1 ～9进 行 了克隆测 序 ，并将测 序结 果与 Ge n b a n k中 已知 序 列 进行 了 B l a s t比对 ，结 果 如 表 2所 示 。由表 2可 以看 出 ，条 带 3同假 单胞 菌 P s e u d o mo n a s s p ． 相 似 性 可达 9 8 以上 ，这与 目前 关 于石 油 降 解 菌多 为假 单 胞菌 的报 道较 为一致 一 “ 。但是 假单 胞 菌是 细 菌 分类 中较大 的一 类 ，不 同菌 种 对底 物 的选 择存 在 较 大差 异 ，而在 本 试 验 土壤 中 ，假 单 胞 菌 在 石 油进 入 土壤 后其 数量 水 平 显著 降低 甚 至 检 测 不 出 ，说 明石 油烃 对该 菌株 的毒性 较 为 严 重 。条 带 4序 列属 于根 瘤 菌属 Br a d y r h i z o b i u m 细 菌 ，该 带 在 石 油重 污 染 区域 仍然存 在并 显示 出一 定 浓 度 ，说 明 其 在发 挥 固 氮作 用 的 同时 也 利 用 石 油 作 为 碳 源 进 行 生 长 繁 殖 。 条带 5与 Me t h y l i b i u m s p ．具 有 9 6 的 相似 性 ，该 菌属 对醚类 的代谢 能力 已经 被 报 道 。从 条带 4和 条带 5在 图谱 中 出现 的位 置及 条 带 的信 号可 以推 测 ， 这两种 细 菌对石 油 具 有 一 定 的 耐受 范 围 ，超 出此 范 围 ，菌株 的生 长繁 殖 就 会 受 到抑 制 ，因 为在 石 油 含 量 更 高 的土壤 E和 F中并没 有 出现 ；条带 6序列 同 菌株Tr i c h o c o c c u s f l o c c u l i f o r mi s相 似 性 为 9 4 ， 在 每个 采 样 点 中均 出 现 ，属 于 土 壤 中 的土 著 类 群 ， 该 种群 在任 随周 等0 。 和 No b u y u k i 等0 关 于石 油 污 染 土壤 微生 物种 群分 析 的研究 中也 提 出过 。 表 2 6个土样的细菌 P C R - D GG E图谱条 带克隆测序结果 Ta bl e 2 Cl o n e s e qu e n c i ng r e s ul t s o f b a nd s f r o m ba c t e r i a l PCR DG GE pr of i l e s o f s i x s o i l s a m pl e s 然 而 条带 2 、7 、8 、9分 别 同 L a c t o c o c c u s s p ． 、 Ac hr o mo b ac t e r xyl o s o xi dan s、 AZ c 以Z gP ， 2 以c e 以P b a c t e r i u m 及 Al c a n i v o r a x s p ． 等菌 株相 似 性 较 高 ， 并 可能 与石油 降 解具 有 密 切 关 系 ，因 为这 些 菌 在 对 石油污 染土壤 中微 生 物 种群 分 析 中经 常被 检 测 出来 或者 已经获得 其纯 培养 物u 。 。虽 然 条 带 1所 对 应 的菌 株 目前 还 没有 被 筛 选 得 到 ，但 是从 条 带 信 号 的强度 可 以推 测 ，其 可 以利 用 石 油 进 行 生 长 繁 殖 。 对 于随着 石油进 入 土 壤 后 逐渐 富集 起 来 的 菌株 ，应 侧 重进行 筛选 ，可 以 为开 发 石 油 污染 土壤 微 生 物 修 复 技术 提供 高效 的微 生物种 源 。 3 结 论 1 采 用不 依 赖 于 纯 培养 的 P C R D GG E 技 术 ， 解 析 了石 油 污染 条件 下土壤 中细菌群 落 的结构 特征 。 2 石 油 进 入 土 壤 后 ，某 些 种 菌 假 单 胞 菌 Ps e u d o mo n a s s p ． 的数 量 水 平 显 著 降低 ，甚 至 检 测 不出 ； 某些菌属Br a d y r h i z o b i u m s p ． 和 Me t h y l i b i u m s p ． 对 石 油 具 有 耐 受 阈 值 ， 只 出 现 在 一 定石 油含 量 的土壤 中 ；某 些 菌属 T r i c h o c o c c u s 5 0 O 5 0 ● 0 O 9 3 2 石油学报 石油加工 第 2 6 卷 厂 z o c c “ z ／ r s 属 于土 壤 中的 常驻 菌 群 ，石 油 污染 对 其生 长繁 殖 影 响 较 小 ；某些 菌 属 如 L a c t o c o c c u s s p ．、 Ac h r o mo b ac t e r zyl o s o xi dan s、 AZ f 以 P 口f g “ 8 b a c t e r i u m、Al c a n i v o r a a c s p ． 在 石 油 进 入 土 壤 后 表 现出在数 量水平 上 的显 著 增加 。这 些 已知菌 属 可 以 在微生物修复技术的开发过程 中，为种源的选择提 供参考 。 参 考 文 献 E l l VA s uD E VAN N， R A J AR AM P ． B i o r e me d i a t i o n o f o i l s l u d g e c o n t a mi n a t e d s o i l [J] ． E n v i r o n me n t I n t e r n a t i on a l ，2 001，2 640 9 41 1． [ 2 ]陆秀君 ， 郭 书海，孙清 ，等．石油 污染土壤 的修 复技术 研究现 状 及 展 望 [ J ] ．沈 阳农 业 大 学 学 报，2 0 0 3 ，3 4 1 6 3 6 7 ． LU x i u j u n，GUO S h u h a i ，S UN Qi n g， e t a 1 ． Cu r r e n t s i t ua t i o n o f r e me d i a t i n g t e c hn i q ue s o f p e t r o l e u m c o n t a mi n a t e d s o i l a n d i t s p r o s p e c t s[ J ] ． J o u r n a l o f S h e n y a n g Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y ，2 0 0 3 ，3 4 16 3 6 7 ． [ 3 ]MI S S HR A S ， J Y 0T J ．I n s i t u b i o r e me d i a t i o n p o t e n t i a l o f a n o i l y s l u d g e d e g r a d i n g b a c t e r i a l c o n s o r t i u m [ J ] ． Cu r r e n t M i c r ob i ol o gy，2 0 01，43 53 28 3 35 ． [ 4 ]B E NY AHI A F ，AB D UL K AR I M M，Z E K R I A，e t a 1 ． Bi o r e me di a t i o n o f c r u de oi l c o nt a mi n a t e d s oi l s a bl a c k a r t o r a n e n g i n e e r i n g c h a l l e n g e [ J] ． I n s t i t u t i o n o f Ch e mi c a l E n g i n e e r s Tr a n s I Ch e mE，Pa r t B ．2 0 0 5 ，8 3 B43 64 37 0． F 5 ]顾传辉 ， 陈桂珠．石油污染 土壤生物降解生 态条 件研 究 [ J ] ． 生 态 科 学 ，2 0 0 0 ，4 6 7 7 2 ． GU C h u a n h u i ， CHEN Gui z hu．Re s e a r c h o f b i or e me d i at i o n c o ndi t i o n of p e t r o l e u m c o n t a mi n a t e d s o i l[ J ] ． E c o l o g i c S c i e n c e ， 2 0 00，467 72 ． [ 6 ]S Z E KE L Y A J ， S I P OS R， B E R TA B ， e t a 1 ．D GG E a n d T RFI P a n al y s i s of b a c t e r i a l s u c c e s s i on d ur i ng mu s hr o o m c o mpo s t p r o du c t i on a nd s e qu e nc e a i de d T R F I P p r o f i l e o f ma t u r e c o mp o s t[ J ] ． Mi c r o b i a l Ec o l o gy，20 09，575 2 2 5 3 3． [ 7 ]S TA C H J E M，B A THE S ，C L A P P J P ， e t a 1 ． PCR S SCP c o mpa r i s o n o f 1 6 S r DNA s e q ue n c e d i ve r s i t y i n s o i l DNA o bt a i ne d u s i ng di f f e r e n t i s ol a t i on a n d p u r i f i c a t i o n me t h o d s [ J ] ．F E MS Mi c r o b i o l o g y E c o l o g y ， 2 0 01，36 2 - 31 39 1 5 1 ． E 8 ]邢薇 ， 左剑恶 ， 孙寓娇 ，等．利用 F I S H 和 DG G E对产 甲烷颗 粒 污 泥 中微 生 物 种 群 的研 究 [ J ] ．环境 科 学 ， 2 0 0 6，1 1 2 2 6 8 2 2 7 2 ． XI NG W e i ， Z UO J i a n e ，S UN Yu j i a o， e t a 1 ． S t u d y o n mi c r o b i a l c o mmu n i t y i n me t h a n o g e n i c g r a n u l a r s l u d g e b y F I S H a n d D G G E [ J ] ． En vi r o nme n t a l S c i e nc e ． 2 0 06，1 122 68 2 27 2． [ 9 ]MUY Z E R G，WA I I E C D，UI T TE R I I N DE N A G ． Pr o f i l i ng o f c o mp l e x mi c r ob i a l p op ul a t i on s by d e n a t ur i n g gr a di e nt g e l e l e c t r 0 ph or e s i s a na l ys i s of p ol yme r a s e c ha i n r e a c t i o n a mp l i f i e d g e n e s c o d i n g f o r 1 6 S r R NA [ J ] ． Appl i e d Env i r o nme nt a l M i c r ob i ol og y， 1 99 3， 5 9 6 9 5 7 O O． [ 1 o ]王君 ， 马挺 ， 刘静 ， 等．利用 P C R D OG E技术指导高温 油藏 中功能微生物的分离[ J ] ．环境科学 ， 2 0 0 8 ， 2 9 2 4 6 2 4 6 8 ． WANG j u n ， MA r i n g， L I U j i n g ， e t a 1 ． I s o l a t i on o f f un c t i on a l ba c t e r i a gu i de d by PCR DGGE t e c hn o l o gy f o r m hi gh t e mpe r a t ur e pe t r o l e u m r e s e r v oi r s _ J ] ． E n v i r o n me n t a l S c i e n c e ，2 0 0 8 ，2 ，2 9 2 4 6 2 46 8 ． [ 1 1 ]R AMI R E Z I J D，E S P O NO S A E E ，T OR R E S E F， e t a 1 ． De s i gn of ba c t e r i a l d e f i ne d mi x e d c ul t ur e s f or bi o de g r a da t i on o f s pe c i f i c c r ud e oi l f r a c t i o ns， u s i ng p o p u l a t io n d y n a mi c s a n a l y s i s b y D GG E E J ] ．I n t e r n a t i o n a l B i o d e t e r i o r a t i o n B i o d e g r a d a t i o n ，2 0 0 8 ，6 2 2 1 3 O ． [ 1 2 ]贾建丽 ， 李， 贸 ， 张旭，等．基于 P C R D O G E技术 的石 油污染土壤微生物多态性[ J ] ．清华大学学报 自然科学 版 ， 2 0 0 5 ， q 9 1 2 1 7 1 2 2 0 ． J I A J i a n l i ， LI Gua n ghe ，ZHAN ；Xu，e t a1 ． M i c r o bi a l c ommun i t i e s i n p e t r o l e u m p o l l u t e d s o i l s b y P C R D GG E[ J ] ． J o u r n a l Ts i n g h u a Un i v S c i＆ Te c h ． 2 0 0 5 ，4 5 9 1 2 1 7 1 2 20 ． [ 1 3 ]赵兴青 ，杨柳燕 ，陈灿 ，等．P C R D O GE技 术用于湖泊 沉积物 中微 生物群 落结构 多样性 研究 [ J ] ．生 态学报 ， 2 0 06， 2 61 136 1 0 3 61 6． ZHA0 Xi n gq i ng， YANG I i u ya n， CHEN Ca n， e t a 1 ． St u dy on t h e mi c r o bi a l di ve r s i t y i n l a ke