燃煤型氟中毒对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响.doc

燃煤型氟中毒对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响 作者张永春1 ， 孙发2*﹡， 谷江2， 石家齐2， 谢春3， 肖跃海2， 李崇斌2 作者单位1.重庆医科大学 泌尿外科， 重庆400016; 2.贵阳医学院附院 泌尿外科, 贵州 贵阳550004; 3.贵阳医学院公共卫生学院, 贵州 贵阳550004 【摘要】 目的 观察燃煤型氟中毒对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。方法 5月龄SD雄性大鼠18只，按体质量随机分为染氟组、染氟大豆组和对照组，各组大鼠自由饮用自来水含氟0.5 mg /L;各染氟组采用含氟量为69.33 mg/kg的煤烘玉米饲食，染氟大豆组的大豆重量比为20，对照组采用含氟为9.37 mg/kg的常食玉米饲食，实验期间动物自由进食、进水;染氟第90天，处死大鼠，使用HE染色法和TUNEL方法对大鼠睾丸切片进行染色，观察细胞凋亡情况，结果 染氟组生精细胞凋亡个数高于对照组[278.1725.47个，12921.02个，P0.05];染氟大豆组生精细胞凋亡个数高于对照组[141.55.24个，12921.02个，P005];染氟大豆组生精细胞凋亡数低于染氟组[141.55.24个，278.1725.47个]，P0.05。结论 燃煤型氟中毒可造成大鼠生精细胞凋亡增加，增加营养后可有效减少氟中毒造成的生精细胞的凋亡。 【关键词】 燃煤型氟中毒; 睾丸; 精细胞; 细胞凋亡 [Abstract] ObjectiveTo observe the effect of coalburning caused fluorosis on apoptosis of spermatogenic cells in adult male rats. s Eighteen healthy SD adult male rats aged 6 months were randomly divided into 3 groups 6 in each group Control group group C, fed with normal maize containing 9.37 mg/kg of fluorine, fluoride group group F, fed with coal baked maize containing 69.33 mg/kg of fluoride, and fluoride plus soybean group group S, fed with maize as group F plus 20 soybean. All the rats drank tap water in which sodium fluoride concentration was less than 05mg. Rats in 3 groups were killed in 90 days, and morphological changes of their testis were observed under light microscope after HE staining. The number of apoptosis cells NAC in testis were detected by TUNEL assay. Results NACs of group F 278.1725.47 and group S 141.5524 were bigger than that of group C12921.02P0.05, and NAC of group F was bigger than that of group S P0.05. Conclusions Coalburning caused fluorosis can lead to high apoptosis of spermatogenic cells of rats, and adding nutrition can effectively reduce cellular apoptosis. [Key words]coalburning caused fluorosis; testis; spermatids; apoptosis 燃煤型氟中毒已发现20余年,国内学者对该病进行了大量的研究，其中包括燃煤型氟中毒对骨骼系统[1,2]、中枢神经系统[35]以及儿童智力水平及体格的发育的影响[6]，但目前未见燃煤型氟中毒对睾丸生殖细胞影响的研究，本实验用贵州省六盘水病区煤烘玉米作为主要成分,喂饲大鼠复制氟中毒模型,观察燃煤型氟中毒对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响,为探索燃煤型氟中毒对睾丸生殖细胞的影响机制提供理论依据。 1材料与方法 1.1实验动物及分组 SD大鼠18只,2月龄，体重110～130 g，雄性，贵阳医学院实验动物中心提供。根据实验目的随机分3组表1,每组6只。 表1实验大鼠分组及饲料 1.2实验方法 1.2.1动物的喂养及处死各组大鼠饲养于标准鼠笼，自由进食、饮水含氟0.5 mg/L，参考文献[7]制作动物模型，喂养90 d,观察到染氟组已出现明显的氟斑牙,结合动物一般情况及尿氟结果，脱颈椎处死后取新鲜睾丸组织待用。 1.2.2标本处理及生精细胞凋亡的检测取大鼠右侧睾丸，用体积分数10中性甲醛溶液4 ℃固定48 h后，浸蜡包埋切片。采用末端标记法TUNEL检测,试剂盒为武汉博士德公司原位细胞凋亡检测试剂盒，操作步骤同说明书。光镜下凋亡细胞核特异性染色呈棕褐色，400倍镜下,随机选取5个横截面曲细精管计数凋亡细胞，胞核着棕褐色，且细胞内出现明显粗颗粒作为真阳性凋亡细胞。 1.2.3数据分析数据以xs表示，采用SPSS 13.0统计学软件对阳性凋亡细胞个数进行单因素方差分析，首先F检验其方差齐性，T检验比较组间差异，各组间两两比较，检验水准Q为005。 2结果 2.1HE染色 染氟组见部分生精小管结构破坏，各级生精细胞结构紊乱，细胞肿胀，体积明显增大，胞浆空泡样变性，部分细胞坏死，细胞核碎裂、溶解图1AC，染氟大豆组未见明显区别。对照组睾丸被膜组织、睾丸组织结构、生精小管结构正常，生精小管中精原细胞、各级精母细胞层次清楚。 2.2原位末端标记TUNEL检测结果 与对照组比较，染氟组和营养组可见细胞明显凋亡，具体表现为染氟组的细胞核出现棕褐色颗粒或团块， 图1DF，凋亡细胞主要发生在初级精母细胞和精原细胞,散在分布，细胞核不完整，形态呈不规则的团块状，大小不一致，3组比较，染氟组凋亡细胞明显增多，营养组细胞凋亡介于对照组和染氟组之间，见表2。表23组大鼠睾丸生精细胞凋亡数比较 图13组大鼠睾丸生精细胞 3讨论 随着对地氟病研究的深入，氟对生殖系统的影响逐渐引起人们的重视，在印度和世界上一些受氟中毒危害的人群中广泛流行的不育症,高氟地区不育症男子精液的含氟量、精子自毖率、精子畸形率及不育的发生率均显著高于非高氟区[8]，崔留欣等[9,10]研究发现，通过饮水和腹腔注射的方式摄入氟，可导致大鼠生殖系统的损害和生精细胞的凋亡;姜春霞等[11]对Wistar雄性大鼠进行系统的染氟测试发现，染氟后大鼠总生精细胞凋亡率、精原细胞凋亡率、精母细胞凋亡率以及精子细胞和精子凋亡率分别高于同期对照组,各染氟大鼠生精细胞凋亡率随染氟剂量的增加和时间的延长而逐渐升高;Alicja Krasowska等[12,13]用田鼠做染氟实验发现，染氟动物模型睾丸生精上皮出血，空泡形成，坏死，睾丸生精细胞凋亡增加。从饮水或者腹腔注射的方式摄入氟，染氟后或过量的氟均可导致生殖细胞的凋亡，但燃煤型氟中毒对男性或者雄性生殖功能的影响，目前未见报道。 本实验以SD大鼠为研究对象，用贵州省六盘水市燃煤型氟中毒病区玉米为食物，自由喂养，模拟病区实际情况，构建燃煤型氟中毒大鼠动物模型，发现染氟90 d后，实验组部分生精小管结构破坏，各级生精细胞结构紊乱，细胞肿胀，体积明显增大，胞浆空泡样变性，部分细胞坏死，细胞核碎裂、溶解，染氟大豆组大鼠睾丸组学表现未见明显区别，对照组睾丸组织结构未见明显变化。TUNEL检测发现，染氟大豆组大鼠睾丸组学表现可见初级精母细胞和精原细胞明显凋亡，染氟组较营养组明显，表明燃煤型氟中毒和其他类型氟中毒相似，可导致生精细胞凋亡，增加营养可一定程度减少凋亡的程度。 燃煤型氟中毒导致大鼠生殖细胞凋亡的机制不清楚。一般认为，精子的发生主要受到下丘脑-垂体-睾丸轴的内分泌调节和睾丸组织内各细胞间相互作用的局部调节，下丘脑分泌促性腺激素释放激素GnRH调控垂体分泌卵泡刺激素FSH和黄体生成素LH,这两种激素调节睾丸精子的发生，FSH 和睾酮T的减少可导致生精细胞的凋亡。燃煤型氟中毒导致生殖细胞凋亡的原因是影响下丘脑-垂体-睾丸轴一个环节还是多个环节、或主要影响哪个环节，还有待进一步的研究。 【参考文献】 [1]刘秉慈，许增禄，缪庆，等.实验性氟中毒骨组织中Ⅱ型胶原基因表达及结构的改变[J].中华预防医学杂志，20034243 246. [2]陈绪光，周石.氟铝联合中毒的骨转换征象[J].氟研究通讯，19931-2148. [3]官志忠,王亚南，GustavD.氟中毒引起SH2SY5Y神经细胞磷脂脂肪酸组成改变[J].贵阳医学院学报，20046471-474. [4]李俊平，王俊东，梁占学,等.高氟对中枢神经系统的影响[J].中国兽药杂志，2004938-47. [5]向全永，王彩生，梁友信,等.氟对神经系统的毒性作用[J].中国地方病学杂志，20051114-116. [6]王守英，张合喜，范伟,等.燃煤型地方性氟中毒对儿童体格发育及智力水平的影响[J].临床实用儿科杂志，20059897-899. [7]谢春，张华，喻茂娟，等.燃煤型氟中毒大鼠血清骨保护素的变化[J].中国地方病学杂志，20054378-381. [8]刘鸿德.高氟区男性不育症调查分析[J].苏州医学院学报,19834297. [9]崔留欣，姜春霞，王锡林，等.氟致雄性大鼠生殖功能损害的实验研究[J]，中国地方病学杂志，200323195-197. [10]崔留欣，姜春霞，程学敏.氟致大鼠生精细胞凋亡的研究[J].中国地方病学杂志,20052025-27. [11]姜春霞，范清堂，程学敏，等.染氟大鼠生精细胞凋亡和血清雌二醇水平的关系[J].卫生研究, 34132-35. [12] Alicja Krasowsku，Tadeusz Wlostowski.Photoperiodic elevation of testicular zinc protects seminiferous tubules against fluoride toxicity in the bank vole clethrionomys glareolus[J].Comp Biochem Physiol,1996181-84. [13] Alicja Krasowska，Tadeusz Wostowski， Elizbieta Bonda，et al，Zinc protection from fluorideinduced testicular injury in the bank vole Clethrionomys glareolus[J].Toxicology Letters,2004147229-235.